In the eukaryotic cell nucleus DNA needs to be highly condensed. The initial level of DNA compaction is mediated by the wrapping of DNA around histone octamers to form nucleosomes. For efficient DNA metabolism, including DNA replication, transcription, repair and recombination, access to the required sequences must be granted. Hence, nucleosomes need to be highly dynamic. This is mediated by ...
Zusammenfassung (Englisch)
In the eukaryotic cell nucleus DNA needs to be highly condensed. The initial level of DNA compaction is mediated by the wrapping of DNA around histone octamers to form nucleosomes. For efficient DNA metabolism, including DNA replication, transcription, repair and recombination, access to the required sequences must be granted. Hence, nucleosomes need to be highly dynamic. This is mediated by ATP-dependent chromatin remodeling complexes. It is still unclear to what extent these enzymes are influenced by local DNA sequences when shifting a nucleosome to different positions. During my PhD thesis I studied ATP-dependent chromatin remodeling factors focusing on the molecular mechanisms of action in dependence on the underlying DNA sequence. I showed that each individual remodeling enzyme possesses distinct nucleosome translocation properties. The direction (outcome) of nucleosome translocation is determined by its underlying DNA sequence and is influenced by other remodeling complex subunits. I demonstrated that nucleosome positioning by two specific motor proteins is determined by the reduced affinity of the remodeling enzyme to the end product of the reaction. In the following, I characterized the kinetic properties of the DNA methyltransferase Dnmt1 in the context of chromatin. DNA methylation is an important epigenetic modification required for a variety of DNA associated processes. Dnmt1 is responsible for the maintenance of methylation patterns. In a second wave of DNA methylation following DNA replication, Dnmt1 needs to access nucleosomal DNA. Using an in vitro approach, I demonstrated that Dnmt1 requires a minimal length of DNA overhangs to bind to mononucleosomes. Furthermore, in vitro mapping of Dnmt1 interactions with its nucleosomal substrate suggests that Dnmt1 needs to contact flanking DNA as well as nucleosomal DNA for efficient binding. Finally, I could show that Dnmt1 methylation activity is inhibited within the nucleosomal core region. Interestingly, addition of recombinant ATP-dependent chromatin remodeling factors abolish the inhibitory effect of the nucleosome, most likely by rendering the nucleosomal DNA accessible to Dnmt1. Taken together, these results suggest a major role for chromatin remodeling enzymes in nucleosome positioning which in turn might be crucial for epigenetic DNA modifications such as DNA methylation.
Übersetzung der Zusammenfassung (Deutsch)
Im eukaryotischen Zellkern liegt die DNA in stark kondensierter Form vor. Die erste Ebene der Chromatin-Kompaktierung wird durch die Windung der DNA um ein Histonoktamer erreicht, wobei ein sogenanntes Nukleosom gebildet wird. Zur Gewährleistung eines effizienten DNA-Metabolismus, wie DNA-Replikation, -Transkription, -Reparatur und -Rekombination müssen die entsprechenden Sequenzen zugänglich ...
Übersetzung der Zusammenfassung (Deutsch)
Im eukaryotischen Zellkern liegt die DNA in stark kondensierter Form vor. Die erste Ebene der Chromatin-Kompaktierung wird durch die Windung der DNA um ein Histonoktamer erreicht, wobei ein sogenanntes Nukleosom gebildet wird. Zur Gewährleistung eines effizienten DNA-Metabolismus, wie DNA-Replikation, -Transkription, -Reparatur und -Rekombination müssen die entsprechenden Sequenzen zugänglich sein. Aus diesem Grund müssen Nukleosomen hoch-dynamisch sein, was von ATP-abhängigen "Chromatin-Remodeling"-Komplexen sichergestellt wird. Jedoch bleibt es bisher unklar, in welchem Ausmaß diese Enzyme von der lokalen DNA-Sequenz beeinflußt werden, wenn sie ein Nukleosom zu verschiedenen Positionen dirigieren. In meiner Doktorarbeit habe ich mich mit ATP-abhängigen Chromatin-Remodeling-Faktoren beschäftigt, wobei der Fokus auf deren molekularen Wirkungsmechanismen in Abhängigkeit von der lokalen DNA-Sequenz lag. Ich konnte zeigen, dass jedes individuelle Chromatin-Remodeling-Enzym spezifische Eigenschaften zur Nukleosomen-Positionierung besitzt. Der Endpunkt der Nukleosomen-Translokation wird hierbei durch die lokale DNA-Sequenz und zusätzliche Proteinuntereinheiten des Remodeling-Komplexes bestimmt. Weiterhin konnte ich für zwei spezifische Motorproteine nachweisen, dass die Nukleosomen-Positionierung durch eine verminderte Bindungsaffinität der Enzyme zum Endprodukt bestimmt wird. Im weiteren Verlauf meiner Arbeit charakterisierte ich die kinetischen Eigenschaften der DNA Methyltransferase 1 (Dnmt1) am nucleosomalen DNA-Substrat. DNA-Methylierung ist eine epigenetische Modifikation, die für verschiedene DNA-basierte Prozesse essentiell ist. Dnmt1 ist für die Aufrechterhaltung des Methylierungsmusters im Anschluss an die DNA-Replikation verantwortlich. Dabei benötigt Dnmt1 Zugang zu nucleosomaler DNA. Anhand eines in-vitro-Ansatzes konnte ich zeigen, dass Dnmt1 eine an das Nukleosom angrenzende minimale Länge von DNA-Überhängen ("Linkern") benötigt, um an Mono-Nukleosomen binden zu können. Weiterhin zeigten Dnmt1 in vitro "Mapping"-Experimente Interaktionen mit dem nukleosomalen Substrat; ein Hinweis, dass Dnmt1 für eine effiziente Bindung sowohl den Kontakt zu flankierenden DNA-Sequenzen als auch zu nukleosomaler DNA benötigt. Ferner konnte ich nachweisen, dass die katalytische Aktivität von Dnmt1 in der Nukleosomenkern-Region stark vermindert ist. Die Zugabe von Remodeling-Komplexen zum nukleosomalen Reaktionsansatz stimulierte die enzymatische Dnmt1-Gesamt-Aktivität auf das an freien DNA-Substraten gemessene Ausgangsniveau. Zusammenfassend zeigen diese Resultate die spezifische und präzise Positionierung von Nukleosomen durch Chromatin-Remodeling-Enzyme und den damit verbundenen wichtigen Einfluss auf epigenetische Modifikationen wie die DNA-Methylierung.
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