Das Protein Sam68 (src-associated in mitosis, 68 kDa) ist an vielen zellulären Prozessen wie z. B. der Zellzyklus- oder Apoptose-Regulation beteiligt. Darüber hinaus wurde gezeigt, dass es für den RNA-Metabolismus des humanen Immundefizienz-Virus (HIV) von Bedeu¬tung ist, wobei verschiedene Mechanismen diskutiert werden. Sam68 besitzt eine zentrale RNA-Bindungsdomäne, die von unstrukturierten ...
Zusammenfassung (Deutsch)
Das Protein Sam68 (src-associated in mitosis, 68 kDa) ist an vielen zellulären Prozessen wie z. B. der Zellzyklus- oder Apoptose-Regulation beteiligt. Darüber hinaus wurde gezeigt, dass es für den RNA-Metabolismus des humanen Immundefizienz-Virus (HIV) von Bedeu¬tung ist, wobei verschiedene Mechanismen diskutiert werden. Sam68 besitzt eine zentrale RNA-Bindungsdomäne, die von unstrukturierten Bereichen mit zahlreichen Andockstellen für Signaltrans¬duktions¬proteine flankiert wird. Dazu gehören sieben Prolin-reiche Sequenzen (P0 bis P6) mit Kern-PxxP-Motiv, die als potentielle Bindestellen für SH3-Domänen fungieren. Zwar wurden in der Literatur bereits einige Proteine beschrieben, die SH3-vermittelt an Sam68 binden, aber eine systematische Analyse des SH3-Bindungsprofils wurde bislang nicht durchgeführt. Daher wurde in der vorliegenden Arbeit ein Phagen-Display-Verfahren unter Einsatz einer Bibliothek, die alle humanen SH3-Domänen abbildet, durchgeführt. Dabei wurden mehr als 30 potentielle Sam68-Binder identifiziert. Unter den neun Domänen, die mit höchster Affinität gebunden hatten, befanden sich sechs bereits bekannte (Fyn, Lyn, Nck1, p85alpha, Src und Yes) sowie drei erstmals als Binder beschriebene SH3-Domänen (Hck, Intersectin 2, OSF1). Wegen der beobachteten Breite an Interaktionspartnern wird vorgeschlagen, Sam68 als Scaffold-Protein zu betrachten. Die detaillierte Charakterisierung dieser SH3-Domänen ergab, dass ihnen nur die Sam68-Motive P0, P3, P4 und P5 als Andockstellen dienen. Um festzustellen, ob Sam68-SH3-Wechselwirkungen eine Rolle im Rahmen der HIV-Replikation spielen, wurden Sam68-Mutanten ohne die relevanten SH3-Bindestellen erzeugt (Sam68-Delta-Px). Die Überexpression von Sam68-Delta-Px während der HIV-Replikation hatte jedoch keine Auswirkungen auf die Partikelproduktion. In einem System mit funktionellem Knock-down des endogenen Sam68 durch die Mutante Sam68-Delta-C erwiesen sich die Sam68-Delta-Px-Mutanten als genauso wirksam wie das Wildtyp-Protein zur Komplementierung des Sam68-Delta-C-Defekts. Sam68-SH3-Interaktionen sind also höchstwahrscheinlich entbehrlich für die Funktion, die Sam68 während der HIV-Replikation wahrnimmt. Die Expression der hoch-affinen SH3-Domäne Yes und seiner Variante Yes-opt (60-fach höhere Affinität) führte hingegen zu einer starken Beeinträchtigung der Partikelproduktion im HIV-Replikations-Assay. Höchstwahrscheinlich binden diese isolierten SH3-Domänen an Sam68 und stören die Komplexbildung mit anderen wichtigen Komponenten. Die SH3-Domänen stellen also interessante Kandidaten für eine potentielle HIV-Gentherapie dar, da sie gegen ein zelluläres, aber für das Virus essentielles Protein gerichtet sind. Varianten der SH3-Domänen mit zusätzlich angefügter Kernexportsequenz mit dem Ziel, die subzelluläre Lokalisation von Sam68 zu verändern, wiesen ebenfalls eine starke antivirale Wirkung auf, was sich jedoch als Sam68-unabhängiger Effekt herausstellte.
Übersetzung der Zusammenfassung (Englisch)
The protein Sam68 (src-associated in mitosis, 68 kDa) is involved in many cellular processes like cell-cycle or apoptosis regulation. Furthermore it has been shown to be important for the RNA metabolism of human immunodeficiency virus (HIV), although different mechanism of action are discussed. Sam68 comprises a central RNA-binding domain flanked by unstructured regions, which contain docking ...
Übersetzung der Zusammenfassung (Englisch)
The protein Sam68 (src-associated in mitosis, 68 kDa) is involved in many cellular processes like cell-cycle or apoptosis regulation. Furthermore it has been shown to be important for the RNA metabolism of human immunodeficiency virus (HIV), although different mechanism of action are discussed. Sam68 comprises a central RNA-binding domain flanked by unstructured regions, which contain docking sites for signal transduction proteins. Among them are seven proline-rich sequences (P0 to P6) with a PxxP core motif, that serve as potential docking sites for SH3 domains. Although several proteins which bind to Sam68 via SH3 domains have already been described in the literature, a systematic analysis of the SH3 binding profile has not be made so far. To this end, a phage display procedure applying a library that displays all human SH3 domains has been carried out in the present work. Thereby more than 30 potential Sam68-binders were identified. Among the nine domains with highest binding affinity were six already known ones (Fyn, Lyn, Nck1, p85alpha, Src and Yes) as well as three SH3 domains characterized as binders for the first time (Hck, Intersectin 2, OSF1). Due to the observed breadth of interacting partners it is proposed to consider Sam68 as a scaffold protein. The detailed characterization of these SH3 domains showed that only the Sam68-motifs P0, P3, P4 and P5 serve as docking sites. To determine if Sam68-SH3-interactions play a role in the context of HIV replication, Sam68 mutants without the relevant SH3-binding sites were constructed (Sam68-Delta-Px). However, overexpression of Sam68-Delta-Px during HIV replication had no influence on particle production. In a functional knock-down system of endogenous Sam68 by the mutant Sam68-Delta-C, the Sam68-Delta-Px mutants proved to be as effective as the wild-type protein in complementing the Sam68-Delta-C defect. Therefore, Sam68-SH3-interactions likely are dispensable for Sam68's function during HIV replication. In contrast, the expression of the high-affinity SH3-domain Yes and it's variant Yes-opt (60-fold increased affinity) severely impaired particle production in an HIV replication assay. Most likely these isolated SH3 domains bind to Sam68 and disturb complex formation with other important components. Therefore these SH3 domains represent interesting candidates for a potential HIV gene therapy approach, since they target a cellular protein that is essential for the virus. Addition of a nuclear export sequence to the SH3 domains with the aim to change Sam68's subcellular localization also exhibited a potent antiviral effect, which, however, proved to be independent of Sam68.
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