Nuclear architecture and structural dynamics - molecular basis of chromatin remodeling induced by human ISWI machines - - University of Regensburg Publication Server

URN to cite this document:: urn:nbn:de:bvb:355-epub-159929
DOI to cite this document:: 10.5283/epub.15992

Exler, Josef H.

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Date of publication of this fulltext: 10 Aug 2011 07:26

Details

Item type:	Thesis of the University of Regensburg (PhD)
Open Access Type:	Primary Publication
Place of Publication:	Regensburg
Number of Pages:	200
Date:	10 August 2011
Referee:	Prof. Dr. Gernot Längst and Prof. Dr. Reinhard Sterner and Prof. Dr. Ralf Wagner
Date of exam:	15 July 2010
Institutions:	Biology, Preclinical Medicine > Institut für Biochemie, Genetik und Mikrobiologie > Lehrstuhl für Biochemie III
Interdisciplinary Subject Network:	Not selected
Keywords:	Chromatin Remodeling, SNF2H, SNF2L, kooperative Bindung, MNase, Zellkernarchitektur, aktive Chromatindomänen, ENCODE
Dewey Decimal Classification:	500 Science > 570 Life sciences
Status:	Published
Refereed:	Yes, this version has been refereed
Created at the University of Regensburg:	Yes
Item ID:	15992

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Abstract (English)

Abstract (English)

One striking observation made when revealing the genetic code of humans was the relative small number of protein encoding genes that were found. The increased complexity of this biological system was not reflected by an increased number of genes. Nevertheless for higher vertebrates an expansion in genome sizes was observed [Yoo and Crabtree, 2009].
Only a small fraction of the genetic code is translated into proteins (approximately 2 %), although over 90% of the genome is transcribed. Therefore, not the number of coding sequences grew, but the complexity of the machinery helping to interpret and functionally use the information increased during evolution [International Human Genome Sequencing Consortium, 2004; Carninci et al., 2008]. A complex interaction network generates a specific spatial and temporal pattern of cellular activities. This allows formation of complex organisms based on a limited number of genes. The highly dynamic chromatin structure is a prerequisite for the flexible interpretation of the genetic information.
One important class of enzymes directly changes the structure of chromatin by assembling and repositioning nucleosomes. These chromatin remodeling complexes nicely reflect the complexity of the DNA organization and interpretation machinery. Assembly of chromatin remodeling complexes from several ATP-dependent DNA translocases in combination with numerous regulatory subunits generates a large combinatorial diversity [Rippe et al., 2007; Ho and Crabtree, 2010]. Especially during development of the nervous system, activity of diverse remodeling complexes is crucial [Yoo and Crabtree, 2009]. ATPases of the ISWI class are often found in complexes playing an important role during neural development. The genome of the fruit fly Drosophila melanogaster encodes only one ISWI ATPase. In mammalians like human and mouse it is more complex, they have two different ISWI class remodeler named SNF2H and SNF2L. Although having a highly similar protein structure, both enzymes show a distinct spatial and temporal expression pattern [Lazzaro and Picketts, 2001]. Nevertheless, the detailed differences and molecular basis of this specialization remained unclear.
The data presented in this thesis reveal that human ISWI remodeler are highly cooperative nucleosome binder. It is shown that cooperative binding of these chromatin modifiers is predominately seen for nucleosomal substrates. DNA is bound much less cooperative, but with a high affinity. In addition, both enzymes form higher molecular weight complexes, mainly di- and tetramers, also in absence of DNA or nucleosomal substrates. They both differ qualitatively and quantitatively in the way they bind to nucleosomes. For mono-nucleosomal substrates, SNF2H shows a more cooperative binding than SNF2L does, while affinity to nucleosomes is higher for SNF2L. These differences were also observed for dynamic binding in presence of ATP. Under competitive conditions, SNF2H preferentially binds nucleosomes with longer linker DNA, while substrate binding of SNF2L is not affected by linker length. In contrast to substrate binding, ATP-hydrolysis activity of SNF2L is dependent of nucleosomal linker DNA length and increases with longer linkers, whereas hydrolysis activity of SNF2H is already maximal stimulated by nucleosome core particles. As also published by other groups SNF2H is unable to translocate such linker less nucleosomes [He et al., 2008]. Strikingly, SNF2L pushes the histone octamere over the end of the nucleosomal DNA. In summary, activity of both paralogs is regulated with respect to the substrate structure, but on contrary levels.
In order to analyze chromatin structure and dynamical changes in vivo, induced e. g. by chromatin remodeling machines, an effective method to differentially characterize accessible, active chromatin regions and inactive heterochromatin is crucial. As shown in this thesis, limiting amounts of micrococcal nuclease allow a specific characterization of accessible euchromatin regions.
The isolated chromatin fragments displayed a specific nuclear distribution within distinct decondensed regions as determined by fluorescence in situ hybridization. Comparative microarray hybridization to an ENCODE chip revealed a correlation of these open chromatin fractions with active and therefore euchromatic marks, like histone H3K4 methylation, RNA polymerase II association and transcriptional activity. Furthermore, differences in methylation of mono-, di- and tri-nucleosomal DNA also revealed a specific global pattern of 5-methyl-cytosine modifications within human chromatin. DNA methylation in vivo is mainly restricted to nucleosomal linker regions. Therefore, the established method can be used for further characterisation of active chromatin domains in a relative high resolution. As a next step, the dynamical changes of chromatin structure can be analysed. Direct manipulation by knock-down or overexpression of distinct remodeling enzymes, e. g. SNF2H and SNF2L, within HeLa cells will address the question how chromatin structure and status of these initially charaterized regions changes. Furthermore the question whether DNA methyltransferases gain access to their substrate by structural dynamics, or if their activity is limited to linker DNA regions in general, can be dissected by this approach in a more detailed way.

Translation of the abstract (German)

Eine überraschende Beobachtung, die nach Sequenzierung des genetischen Codes des Menschen gemacht wurde, war die relativ kleine Anzahl von Protein-codierenden Genen, die gefunden wurde. Die erhöhte Komplexität dieses biologischen Systems spiegelte sich nicht in einer Erhöhung der Anzahl der Gene wider. Nichtsdestotrotz wurde eine Expansion der Genomgröße für höhere Wirbeltiere beobachtet [Yoo und Crabtree, 2009]. Nur ein kleiner Anteil des genetischen Codes wird in Proteine translatiert (ungefähr 2%), obwohl über 90% des Genoms transkribiert wird. Daher erhöhte sich nicht die Anzahl der codierenden Sequenzen während der Evolution, aber die Komplexität der Maschinerie, die bei der Interpretation und dem funktionalen Gebrauch der Information hilft [International Human Genome Sequencing Consortium, 2004; Carninci et al., 2008].
Ein komplexes Interaktionsnetzwerk erzeugt ein zeitliches und räumliches Muster zellulärerer Aktivitäten. Dies erlaubt die Bildung von komplexen Organismen basierend auf einer limitierten Anzahl von Genen. Die hoch dynamische Struktur des Chromatins ist eine Vorraussetzung für die flexible Interpretation der genetischen Information. Eine wichtige Klasse von Enzymen verändert direkt die Struktur des Chromatins durch Assemblierung und Repositionierung der Nukleosomen. Diese Chromatin Remodeling Komplexe spiegeln sehr schön die Komplexität der DNA Organisations- und Interpretationsmaschinerie wider. Die Zusammensetzung von Chromatin Remodeling Komplexes aus mehreren ATP-abhängigen DNA Translokasen in Verbindung mit zahlreichen regulatorischen Untereinheiten erzeugt eine große kombinatorische Vielfalt [Rippe et al., 2007; Ho und Crabtree, 2010]. Speziell während der Entwicklung des Nervensystems ist die Aktivität verschiedener Remodeling Komplexes notwendig [Yoo und Crabtree, 2009]. ATPasen der ISWI Klasse werden oft in Komplexen gefunden, die eine wichtige Rolle während der neuronalen Entwicklung spielen. Das Genom der Fruchtfliege Drosophila melanogaster codiert nur für eine ISWI ATPase. In Säugetieren, wie dem Menschen und der Maus, ist es komplexer, sie haben zwei unterschiedliche ISWI Klassen Remodeler, genannt SNF2H und SNF2L. Obwohl sie eine sehr ähnliche Proteinstruktur haben, zeigen beide Proteine ein klares räumliches und zeitliches Muster in ihrer Expression [Lazzaro und Picketts, 2001]. Nichtsdestotrotz sind die genauen Unterschiede und die molekulare Grundlage dieser Spezialisierung bisher unklar. Die in dieser Dissertation präsentierten Daten zeigen, dass humane ISWI Remodeler hoch kooperative Nukleosomenbinder sind. Es konnte gezeigt werden, dass kooperative Bindung dieser Chromatinmodifizierer hautsächlich für nukleosomale Substrate beobachtet wird. DNA wird viel weniger kooperativ gebunden, aber mit einer hohen Affinität. Zusätzlich bilden beide Enzyme höher molekulare Komplexe, hauptsächlich Di- und Tetramere, auch in Abwesenheit von DNA oder nukleosomalen Substraten. Beide unterscheiden sich qualitativ und quantitativ in der Art und Weise wie sie Nukleosomen binden. Für mono-nukleosomale Substrate zeigt SNF2H ein kooperativeres Bindeverhalten als SNF2L, während die Affinität zu Nukleosomen für SNF2L höher ist. Diese Unterschiede wurden auch für dynamische Bindung in Anwesenheit von ATP beobachtet. Unter kompetitiven Bedingungen bindet SNF2H bevorzugt Nukleosomen mit längeren Linker-DNA, während die Substratbindung von SNF2L nicht durch die Länge der Linker-DNA beeinflusst wird. Im Unterschied zur Substratbindung ist die ATP-Hydrolyseaktivität von SNF2L abhängig von der Länge der Linker-DNA, und sie erhöht sich mit längeren Linkern, wohingegen die Hydrolyseaktivität von SNF2H bereits durch Nukleosomen-Kern-Partikel maximal stimuliert wird.
Wie auch schon von anderen Gruppen publiziert, ist SNF2H nicht in der Lage Linker-lose Nukleosomen zu bewegen [He et al., 2008]. Überraschenderweise schiebt SNF2L Histonoktamere über das Ende der nukleosomalen DNA hinaus. Zusammenfassend wird die Aktivität beider Paraloger in Abhängigkeit der Substratstruktur reguliert, allerdings auf gegensätzlichen Ebenen.
Zur Analyse der Chromatinstruktur und deren dynamischen Umwandlungen in vivo, z. B. induziert durch Chromatin Remodeling Maschinen, ist eine effektive Methode zur differentiellen Charakterisierung von zugänglichen, aktiven Chromatinregionen und inaktivem Heterochromatin essentiell. Wie im Rahmen dieser Promotion gezeigt, erlaubt der limitierte Einsatz von Micrococcus Nuklease eine spezifische Charakterisierung der zugänglichen Euchromatinregionen. Die isolierten Chromatinfragmente zeigten eine spezifische nukleare Verteilung innerhalb dekondensierter Regionen, wie durch Fluoreszenz in situ Hybidisierung gezeigt wurde. Komperative Hybridisierung auf einen ENCODE Mikroarray belegte eine Korrelation von diesen offenen Chromatinfraktionen mit aktiven und daher euchromatischen Markern, wie H3K4 Methylierung, RNA Polymerase II Assoziierung und transkriptionelle Aktivität.
Des weiteren deuteten Unterschiede in der Methylierung von mono-, di- und tri-nukleosomaler DNA auf ein spezifisches globales Muster der 5-Methyl-Cytosine Modifikation innerhalb des menschlichen Chromatins hin. DNA Methylierung ist in vivo hauptsächlich auf nukeosomale Linker-Regionen begrenzt. Daher kann die hier etablierte Methode genutzt werden, um aktive Chromatindomänen in einer relativ hohen Auflösung eingehender zu charakterisieren.
Als nächster Schritt kann die dynamische Umwandlung der Chromatinstruktur analysiert werden. Direkte Manipulationen durch knock-down oder Überexpression von bestimmten Remodeling Enzymen, z. B. SNF2H und SNF2L, in HeLa Zellen würde die Frage nach der Veränderung der Chromatinstruktur und des Status dieser initial charakterisierten Regionen adressieren. Darüber hinaus kann die Frage, ob DNA Methyltransferasen Zugang zur ihrem Substrat durch strukturelle Dynamik erhalten, oder ob ihre Aktivität auf die Linker-DNA im allgemeinen begrenzt ist, kann durch diesen Ansatz detaillierter aufgeklärt werden.

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