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- URN zum Zitieren dieses Dokuments:
- urn:nbn:de:bvb:355-epub-166177
- DOI zum Zitieren dieses Dokuments:
- 10.5283/epub.16617
| Dokumentenart: | Hochschulschrift der Universität Regensburg (Dissertation) |
|---|---|
| Open Access Art: | Primärpublikation |
| Datum: | 11 Oktober 2010 |
| Begutachter (Erstgutachter): | Prof. Dr. Roland Seifert und Prof. Dr. Stefan Dove |
| Tag der Prüfung: | 27 August 2010 |
| Institutionen: | Chemie und Pharmazie > Institut für Pharmazie > Lehrstuhl Pharmakologie und Toxikologie (Prof. Schlossmann, ehemals Prof. Seifert) |
| Themenverbund: | Nicht ausgewählt |
| Stichwörter / Keywords: | Adenylatzyklase-Inhibitoren, MANT-Nukleotide, Röntgenkristallstruktur mit MANT-ITP, Kardiomyozyten, L-typ Calciumkanal, Elektrophysiologie; Adenylyl cyclase inhibitors, MANT nucleotides, crystal structure with MANT-ITP, cardiomyocytes, basal L-type calcium current, whole cell patch clamp technique |
| Dewey-Dezimal-Klassifikation: | 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 570 Biowissenschaften, Biologie 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 540 Chemie 600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften > 610 Medizin |
| Status: | Veröffentlicht |
| Begutachtet: | Ja, diese Version wurde begutachtet |
| An der Universität Regensburg entstanden: | Ja |
| Dokumenten-ID: | 16617 |
Zusammenfassung (Englisch)
Adenylyl cyclases (ACs) play a crucial role in G protein-coupled receptor signaling, because they generate cyclic adenosine 3’,5’-monophosphate (cAMP). AC inhibitors could be applied when pathophysiological high cAMP concentrations are predominant, such as in heart failure or neurodegenerative disorders. 2’,3’-O-(N-Methylanthraniloyl)-nucleoside 5’-triphosphates (MANT-NTPs) are a new class of ...
Zusammenfassung (Englisch)
Adenylyl cyclases (ACs) play a crucial role in G protein-coupled receptor signaling, because they generate cyclic adenosine 3’,5’-monophosphate (cAMP). AC inhibitors could be applied when pathophysiological high cAMP concentrations are predominant, such as in heart failure or neurodegenerative disorders. 2’,3’-O-(N-Methylanthraniloyl)-nucleoside 5’-triphosphates (MANT-NTPs) are a new class of potent AC inhibitors with isoform selectivity for ACs 1, 5 and 6 in comparison to AC 2 and MANT-inosine-5‘-triphosphat (MANT-ITP) is currently the most potent known AC inhibitor. The present work is, on the one hand, about the molecular interaction of MANT-ITP with the catalytic subdomains of membranous AC (mAC) to understand the structure-activity relationship of MANT-NTPs with the enzyme. On the other hand, the effect of different MANT-NTPs in murine cardiomyocytes was analyzed.
With the help of the crystal structure of MANT-ITP in complex with the VC1/IIC2-domains of mAC we could demonstrate that MANT-ITP has an almost identical conformation as MANT-GTP, when both crystal structures are superimposed. Based on a missing NH2-group in the hypoxanthine ring of MANT-ITP the structure does not provide a hydrogen bond to I1019. The apparent decrease in affinity at the purine binding site is more than compensated by an increased interaction with the hydrophobic MANT-binding site, as assessed by fluorescence measurements that show already under basal conditions an intensified direct fluorescence and an increase in fluorescence resonance energy transfer (FRET). Additionally, the MANT-ITP structure shows a better triphosphate-metal ion coordination and stronger interaction with K1065 in the phosphate-binding site which was confirmed with MD simulations. The binding affinity of MANT nucleotides for mAC is regulated via a balance between the purine-, MANT- and phosphate binding site and corroborates a previously made 3-site-pharmacophore model.
AC 5 knockout (AC 5-/-) mice exhibited cardioprotective effects in a pressure-overload model, and cardiomyocytes were protected against apoptosis. Therefore, MANT nucleotides as potent AC inhibitors with a high selectivity for AC 5, such as MANT-ITP, MANT-ITPgammaS, and MANT-GTPgammaS were examined in ventricular wildtype (C57Bl/6) cardiomyocytes. MANT-ATP was used as a negative control, because it possesses a 200-fold lower affinity for AC 5. The substances were applied intracellularly and the indirect influence of ACs on L-type Ca2+ current (ICa,L) was detected via electrophysiological WC measurements. The effects of the MANT nucleotides on ICa,L were unexpectedly complex. MANT-ITP, MANT-ATP und MANT-ITPgammaS showed an initial current increase of ca. 30, 106 and 48%, respectively, followed by a decrease of ICa,L after ca. 2.5 minutes. The characteristics of MANT-GTPgammaS are very similar to control and consistent with already published data. All MANT-NTPs show an inhibitory effect on basal ICa,L, but the overall inhibition in comparison to control is low or not existent, because of the initial current increase. An explanation could be that MANT-NTPs activate/inhibit other target proteins beside the AC inhibition.
Due to the complex, dually stimulatory and inhibitory effects in intact cells, the use of MANT nucleotides should be restricted as valuable fluorescent probes, crystallographic ligands and enzyme inhibitors to analyze recombinant and/or purified nucleotide-binding proteins. Hopefully, new inhibitors will exhibit greater selectivity for AC 5 and also membrane permeability.
Übersetzung der Zusammenfassung (Deutsch)
Adenylylzyklasen (ACs) spielen in der G-Protein-gekoppelten Rezeptor-Signalkaskade eine entscheidende Rolle, weil sie einen wichtigen intrazellulären Botenstoff, zyklisches Adenosinmonophosphat (cAMP), synthetisieren. AC-Inhibitoren könnten pharmakotherapeutisch bei pathophysiologisch erhöhten cAMP-Konzentrationen eingesetzt werden, die bei Herzinsuffizienz, aber auch bei neurodegenerativen ...
Übersetzung der Zusammenfassung (Deutsch)
Adenylylzyklasen (ACs) spielen in der G-Protein-gekoppelten Rezeptor-Signalkaskade eine entscheidende Rolle, weil sie einen wichtigen intrazellulären Botenstoff, zyklisches Adenosinmonophosphat (cAMP), synthetisieren. AC-Inhibitoren könnten pharmakotherapeutisch bei pathophysiologisch erhöhten cAMP-Konzentrationen eingesetzt werden, die bei Herzinsuffizienz, aber auch bei neurodegenerativen Erkrankungen vorkommen. 2’,3’-O-(N-Methylanthraniloyl)- (MANT-) Nukleotide stellen eine Klasse von AC-Inhibitoren dar, die eine Selektivität für ACs 1, 5 und 6 gegenüber AC 2 aufweisen. MANT-Inosin-5‘-triphosphat (MANT-ITP) ist der potenteste Wirkstoff dieser Klasse. Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich einerseits mit der molekularen Interaktion von MANT-ITP mit den aktivierten katalytischen Untereinheiten der membranären AC (mAC), um die Struktur-Wirkungsbeziehung von MANT-Nukleotiden besser zu verstehen. Andererseits wurde die Wirkung verschiedener MANT-Nukleotide in intakten Kardiomyozyten der Maus analysiert.
Anhand der Kristallstruktur von MANT-ITP im Komplex mit der VC1/IIC2 Untereinheit von mAC konnte gezeigt werden, daß MANT-ITP eine fast identische Konformation wie MANT-GTP aufweist, wenn beide Kristallstrukturen übereinandergelegt werden. Aufgrund einer fehlenden NH2-Gruppe im Hypoxanthinring von MANT-ITP wird eine Wasserstoff-brückenbindung zu I1019 nicht ausgebildet. Die scheinbare Affinitätsminderung in der Purinbindungstasche wird durch eine verstärkte Interaktion mit der hydrophoben MANT-Bindungstasche mehr als ausgeglichen. Fluoreszenzmessungen bestätigten, dass sowohl die direkte Fluoreszenz als auch der Fluoreszenzresonanz-Energietransfer (FRET) mit MANT-ITP aufgrund der hydrophoben Wechselwirkung unter basalen Bedingungen erhöht sind. Außerdem zeigte die MANT-ITP-Struktur eine verbesserte Phosphat-Metallionen-Koordination und eine verstärkte Interaktion mit K1065 in der Phosphat-Bindungstasche, was durch MD-Simulationen bestätigt wurde. Die Bindungsaffinität von MANT-Nukleotiden für mAC wird durch ein Gleichgewicht zwischen Purin-, MANT- und Phosphat-Bindungstasche hervorgerufen und bestätigt ein bereits bestehendes trimeres Pharmakophor-Modell.
In AC 5 Knockout-Mäusen zeigte sich, dass das Fehlen der AC 5 eine kardioprotektive Wirkung im druckbelasteten Herzen hat und Apoptoseprozesse in Kardiomyozyten verhindert werden. Da MANT-Nukleotide potente AC-Inhibitoren sind und bereits gezeigt wurde, dass sie eine gewisse Selektivität für AC 5 aufweisen, wurden ausgewählte Substanzen (MANT-ITP, MANT-ITPgammaS und MANT-GTPgammaS) in ventrikulären Kardiomyozyten von C57Bl/6-Mäusen untersucht. MANT-ATP wurde aufgrund seiner 200-fach geringeren Affinität für AC 5 als Negativkontrolle eingesetzt. Dabei wurden die Substanzen anhand elektrophysiologischer Ganzzellmessung direkt intrazellulär appliziert und der indirekte Einfluss von ACs auf den L-Typ Calciumkanalstrom (ICa,L) in Herzmuskelzellen von Mäusen vermessen. Die MANT-Nukleotide zeigten sehr komplexe Wirkungen auf ICa,L. MANT-ITP, MANT-ATP und MANT-ITPgammaS zeigten einen ungewöhnlichen initialen Stromanstieg von jeweils ca. 30, 106 und 48% bevor nach ca. 2,5 Minuten der stromhemmende Effekt eintrat. MANT-GTPgammaS entwickelte keinen signifikanten Stromanstieg und war den Kontrollmessungen ähnlich, was bisher publizierten Ergebnissen entspricht.
Alle MANT-Nukleotide haben eine hemmende Wirkung auf den basalen ICa,L, allerdings ist die Gesamtinhibition im Vergleich zur Kontrolle gering oder gar nicht erkennbar. Eine mögliche Erklärung wäre, dass MANT-Nukleotide neben der AC-Inhibition auch andere Zielproteine mehr oder weniger stark aktivieren bzw. inhibieren. Der Einsatz von MANT-Nukleotiden sollte sich auf die Nutzung als Fluoreszenssonden, Liganden zur kristallographischen Strukturanalyse, beziehungsweise als Enzyminhibitoren beschränken. Denn sie eignen sich gut zur Analyse molekularer Wechselwirkungen von rekombinanten und/oder aufgereinigten nukleotid-bindendenden Proteinen. Die bisherig gewonnenen Ergebnisse lassen sich aber durchaus für die Synthese von membrangängigen, selektiveren AC 5 - Inhibitoren für die Entwicklung neuer Arzneistoffe, z.B. zur Therapie der Herzinsuffizienz nutzen. In einem nächsten Schritt wäre es außerdem sehr wichtig, die unspezifischen Aktivierungs- bzw. Hemmeigenschaften der MANT-Nukleotide herauszuarbeiten.
Metadaten zuletzt geändert: 26 Nov 2020 08:21
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