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- URN zum Zitieren dieses Dokuments:
- urn:nbn:de:bvb:355-epub-173130
- DOI zum Zitieren dieses Dokuments:
- 10.5283/epub.17313
| Dokumentenart: | Hochschulschrift der Universität Regensburg (Dissertation) |
|---|---|
| Open Access Art: | Primärpublikation |
| Datum: | 18 Oktober 2010 |
| Begutachter (Erstgutachter): | Prof. Dr. Roland Seifert und PD Dr. Klaus Höcherl |
| Tag der Prüfung: | 27 August 2010 |
| Institutionen: | Chemie und Pharmazie > Institut für Pharmazie > Lehrstuhl Pharmakologie und Toxikologie (Prof. Schlossmann, ehemals Prof. Seifert) |
| Themenverbund: | Nicht ausgewählt |
| Stichwörter / Keywords: | adenylyl cyclase, polycystic kidney disease, forskolin, MANT-nucleotides |
| Dewey-Dezimal-Klassifikation: | 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 570 Biowissenschaften, Biologie 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 540 Chemie |
| Status: | Veröffentlicht |
| Begutachtet: | Ja, diese Version wurde begutachtet |
| An der Universität Regensburg entstanden: | Ja |
| Dokumenten-ID: | 17313 |
Zusammenfassung (Englisch)
Mammalian adenylyl cyclases (mACs) are integral membrane proteins involved in various physiological processes. For instance, they regulate cardiac contractility and kidney function. Malfunctions or the abnormal regulation of AC isoforms cause numerous disease states such like heart failure, polycystic kidney disease (PKD), neurodegenerative diseases, or pain and drug dependency. During the past ...
Zusammenfassung (Englisch)
Mammalian adenylyl cyclases (mACs) are integral membrane proteins involved in various physiological processes. For instance, they regulate cardiac contractility and kidney function. Malfunctions or the abnormal regulation of AC isoforms cause numerous disease states such like heart failure, polycystic kidney disease (PKD), neurodegenerative diseases, or pain and drug dependency. During the past decades, nine distinct mammalian membranous AC isoforms have been identified. These exhibit isoform-specific expression patterns and different regulatory mechanisms. ACs play an important role in transmembrane signaling events of the G protein-coupled receptor (GPCR) cascade and catalyze the conversion from ATP to the second messenger cAMP. Activation of these effector proteins transfers signals from receptors on the cell surface to target molecules inside the cell and contributes to cross-talks in different cell systems and signaling structures.
The first part of this thesis characterizes the detailed interactions of forskolin and six forskolin analogs with recombinant ACs 1, 2 and 5 and determines their effects on isoform-specific AC activity. All seven diterpenes affected the examined AC isoforms in a characteristic manner, strongly rendering the pharmacological profile. Correlations of the pharmacological parameters of these diterpenes between the different AC isoforms showed a distinct isoform-specific profile. Since the amino acids exhibiting direct interactions with the diterpenes are highly conserved among the AC isoforms, the results of this study indicated a contribution of the structural environment around the catalytic core to substrate binding and catalysis. Moreover, differential impacts of Mg2+ and Mn2+ were obtained on mAC activation by diterpenes. However, the metal cofactors showed only low impact on the efficacies of forskolin and its analogs of the purified C1/C2 catalytic subunit plus GSα-GTPγS. Additionally, docking of diterpenes to the C1/C2 mAC protein did not offer metal ion-dependent changes in the docking preferences. Since only small global and local differences between the arrangements of Mg2+ and Mn2+ complexes are obtained, the currently available docking results are not conclusive to solve the impact of the cofactors on AC regulation. Although there are substantial differences in the activity of mAC isoforms, due to differential regulation by metal ions, the biological significance of Mn2+ in the regulation of substrate binding and catalyzing cAMP production remains unclear.
The second part describes a biochemical approach to characterize AC in renal cortical and medullary membranes in comparison to selected recombinant AC isoforms. Considering the paucity of selective and sensitive AC isoform antibodies, the characterization of the renal AC isoforms was performed using a biochemical approach. Analysis of GPCR agonist-mediated, Ca2+-dependent or calmodulin-sensitive cAMP formation were used to differentiate between the AC types in the two main parts of the kidney. The effects of various hormones and neurotransmitters on cortical and medullary ACs detected a tissue-specific distribution of GPCRs and subsequently a distinct regulation of tubular functions. The inhibition of cortical and medullary ACs by eight 2’(3’)-O-(N-methylanthraniloyl) (MANT)-nucleoside 5’-([γ-thio])triphosphates yielded characteristic rank orders of pharmacological parameters for each part of the kidney. In combination with the inhibition patterns of Ca2+ on recombinant ACs 1, 2 and 5 and both renal parts, the classification of the predominant cortical AC isoform as AC type 5 was possible. In the case of medulla, the pharmacological profiles resembled AC isoform 1. The identification of a major AC isoform with biochemical approaches failed, because medullary AC missed the characteristic calmodulin-dependency of AC1. However, the predominance of ACs 1, 2 and 5 could be excluded. Therefore, another isoform - different from type 1, but with similar pharmacological characteristics - seemed to play a crucial role in the medulla. This identification of the prevalent AC isoform provides the basis for exploring ACs as target for the treatment of PKD.
Übersetzung der Zusammenfassung (Deutsch)
Adenylylcyclasen (mACs) von Säugetieren sind integrale Membranproteine, die an diversen physiologischen Prozessen beteiligt sind. Beispielsweise regulieren sie die Kontraktilität des Herzens und die Nierenfunktion. Enzymdefekte oder abnormale Regulationen der mAC Isoformen verursachen zahlreiche Krankheitszustände wie Herzinsuffizienz, polycystische Nierenerkrankung (PKD), neurodegenerative ...
Übersetzung der Zusammenfassung (Deutsch)
Adenylylcyclasen (mACs) von Säugetieren sind integrale Membranproteine, die an diversen physiologischen Prozessen beteiligt sind. Beispielsweise regulieren sie die Kontraktilität des Herzens und die Nierenfunktion. Enzymdefekte oder abnormale Regulationen der mAC Isoformen verursachen zahlreiche Krankheitszustände wie Herzinsuffizienz, polycystische Nierenerkrankung (PKD), neurodegenerative Erkrankungen oder Schmerzzustände und Sucht. Während der letzten Jahrzehnte wurden neun verschiedene membrangebundene AC Isoformen in Säugetieren entdeckt. Diese werden charakterisiert durch isoform-spezifische Gewebeexpression und unterschiedliche Regulationsmechanismen. ACs spielen eine wichtige Rolle in transmembranären Signaltransduktionswegen vermittelt durch G Protein-gekoppelte Rezeptoren (GPCRs) und katalysieren die Umwandlung von ATP in den sekundären Botenstoff cAMP. Die Aktivierung dieser Effektorproteine leiten Signale von Rezeptoren auf der Zelloberfläche weiter zu Zielstrukturen im Inneren der Zelle. Dadurch tragen sie zur Verständigung zwischen verschiedenen Zellsystemen und Signalstrukturen bei.
Der erste Teil dieser Doktorarbeit charakterisiert die Interaktionen von Forskolin und sechs Forskolin-Analoga mit den rekombinanten AC Isoformen 1, 2 und 5 und untersucht deren Effekte auf die AC Aktivität der einzelnen Subtypen. Alle sieben Diterpene beeinflussten die Enzymaktivität der untersuchten mAC Isoformen auf charakteristische Weise und gaben dadurch das pharmakologische Profil wieder. Korrelationen der pharmakologischen Parameter der Diterpene mit den unterschiedlichen mACs zeigten ein individuelles Profil für jede AC Isoform. Da die Aminosäuren, die an der Forskolin-Bindung direkt beteiligt sind, unter den AC Isoformen stark konserviert sind, deuteten die Ergebnisse dieser Untersuchung auf eine Beteiligung der strukturellen Umgebung der katalytischen Tasche an der Substratbindung und dem Katalysemechanismus hin. Zusätzlich wurden unterschiedliche Auswirkungen von Mg2+ und Mn2+ auf die Diterpen-abhängige Aktivität der mACs beobachtet. Die Kofaktoren zeigten jedoch nur unerheblichen Einfluss auf den Maximaleffekt von Forskolin und den Analoga auf die gereinigte katalytische Einheit C1/C2 plus GSα-GTPγS. Auch das Docking der Diterpene in die C1/C2 mAC-Bindetasche bot keine Kofaktor-abhängigen Unterschiede bei den Docking-Präferenzen. Da nur geringe allgemeine und lokale Unterschiede zwischen der Anordnung von Mg2+ oder Mn2+ in der Kristallstruktur aufgedeckt wurden, stellt das momentan mögliche, molekulare Docking keine beweiskräftige Methode dar, um den Einfluss der Kofaktoren auf die AC Regulation zu ergründen. Trotz grundlegender Unterschiede in der Aktivität der mAC Isoformen bedingt durch die Wahl der Metallionen, ist die biologische Bedeutung von Mn2+ bei der Regulation der Substratbindung und der Katalyse unklar.
Der zweite Teil beschreibt einen biochemischen Ansatz, um die AC Isoformen in Cortex- und Medulla-Membranen der Niere im Vergleich mit ausgewählten rekombinanten AC Isoformen zu charakterisieren. Aufgrund des Mangels an selektiven und sensitiven Antikörpern erfolgte die Charakterisierung der AC Isoformen der Niere mit biochemischen Methoden. Durch GPCR-Agonisten vermittelte cAMP-Bildung, Ca2+-abhängige AC Aktivierung und die Sensitivität gegenüber Calmodulin wurde zwischen den AC Isoformen in den beiden Nierenbereichen unterschieden. Die Effekte einiger Hormone und Neurotransmitter auf die ACs von Cortex und Medulla zeigten eine gewebsspezifische Verteilung der GPCRs und somit eine unterschiedliche Regulation der Tubulusfunktionen. Die Hemmung der Nieren-ACs durch acht 2’(3’)-O-(N-methylanthraniloyl) (MANT)-Nucleosid 5’-([γ-thio])triphosphate erzielten charakteristische Reihenfolgen der pharmakologischen Kenngrößen für jeden Teil der Niere. Zusammen mit dem Inhibitionsschema mittels Ca2+ an rekombinanten ACs 1, 2 und 5 und beiden Nierenbereichen konnte die Identifizierung der vorrangigen AC Isoform des Nierencortex als AC5 vorgenommen werden. Bei der Medulla ähnelten die pharmakologischen Profile jenen von AC1. Die Identifizierung der Haupt-AC mit biochemischen Methoden schlug jedoch fehl, da die medulläre AC Isoform nicht die Calmodulin-Abhängigkeit entsprechend der AC1 aufwies. Es konnten allerdings die ACs 1, 2 und 5 als vorherrschende Isoformen ausgeschlossen werden. Es scheint eine andere Isoform als AC1, aber mit ähnlichem pharmakologischen Profil, die Hauptrolle in der Regulation der Medulla zu spielen. Die Identifizierung der vorrangigen AC Isoform in der Niere schafft die Grundlage für die Erforschung von ACs als Zielstrukturen zur Behandlung der PKD.
Metadaten zuletzt geändert: 26 Nov 2020 08:11
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