| License: Publishing license for publications excluding print on demand (25MB) |
- URN to cite this document:
- urn:nbn:de:bvb:355-epub-180084
- DOI to cite this document:
- 10.5283/epub.18008
| Item type: | Thesis of the University of Regensburg (PhD) |
|---|---|
| Open Access Type: | Primary Publication |
| Date: | 22 November 2011 |
| Referee: | Prof. Dr. Reinhard Sterner |
| Date of exam: | 17 November 2010 |
| Institutions: | Biology, Preclinical Medicine > Institut für Biophysik und physikalische Biochemie > Prof. Dr. Reinhard Sterner |
| Interdisciplinary Subject Network: | Not selected |
| Keywords: | GGGPS, (beta-alpha)8-Fass-Protein, Funktionsaufklärung, Lipide, AraM, PcrB, Polyprenyl, Radioaktivität, Bacillus subtilis, HPLC |
| Dewey Decimal Classification: | 500 Science > 570 Life sciences |
| Status: | Published |
| Refereed: | Yes, this version has been refereed |
| Created at the University of Regensburg: | Yes |
| Item ID: | 18008 |
Abstract (German)
Der Entwicklungsstand der Sequenziertechnik erlaubt mittlerweile die Entzifferung eines bakteriellen Genomes innerhalb weniger Tage. In der nun beginnenden post-genomischen Ära ist es eine der wichtigsten Herausforderung den Produkten der identifizierten Gene Funktionen zuzuordnen. In dieser Arbeit wurde zur Aufklärung der Funktion von Enzymen ein integrativer Ansatz verfolgt. Dabei wurden ...
Abstract (German)
Der Entwicklungsstand der Sequenziertechnik erlaubt mittlerweile die Entzifferung eines bakteriellen Genomes innerhalb weniger Tage. In der nun beginnenden post-genomischen Ära ist es eine der wichtigsten Herausforderung den Produkten der identifizierten Gene Funktionen zuzuordnen.
In dieser Arbeit wurde zur Aufklärung der Funktion von Enzymen ein integrativer Ansatz verfolgt. Dabei wurden Methoden der Bioinformatik, Genetik und Mikrobiologie mit den analytischen Techniken der physikalischen Biochemie kombiniert. Als Kandidat zur Funktionsaufklärung wurde das (βα)8-Fass-Protein PcrB aus B. subtilis gewählt. PcrB hat hohe Ähnlichkeit zu einem Schlüsselenzym der archaeellen Membranlipidsynthese, der Geranylgeranylglycerin-Phosphat-Synthase (GGGPS), die die stereospezifische Kondensation von Geranylgeranylpyrophosphat (GGPP) und Glycerin-1-Phosphat (G1P) katalysiert.
Ausgangspunkt für die Aufklärung der Funktion von PcrB bildete der Vergleich der Kristallstrukturen von PcrB und der GGGPS aus Archaeoglobus fulgidus (afGGGPS), aus dem G1P als ein Substrat auch von PcrB abgeleitet werden konnte. Mit AraM als Glycerin-1-Phosphat-Dehydrogenase konnte das G1P produzierende Enzym in B. subtilis identifiziert werden. Mit dessen Hilfe wurde unter Verwendung der Enzyme der Glycolyse aus 14C-markierte Glucose 14C-G1P synthetisiert und über Papierchromatographie präpariert. Mit dem markierten Substrat G1P konnte somit die Aktivität von PcrB in in vitro und in vivo Experimenten untersucht werden.
Zum einen wurde damit in vitro die GGGPS-Aktivität von PcrB G1P-abhängig nachgewiesen. Um die Fähigkeit von PcrB zu untersuchen den Umsatz längerer Polyprenylpyrophosphate (C25-C30) als das bereits getestete C20-GGPP zu katalysieren, wurde diese Substrate über eine mutierte Polyprenylpyrophosphatsynthease ebenfalls synthetisiert. Es konnte gezeigt werden, dass PcrB diese ebenfalls umsetzen konnte. Im Vergleichsenzym afGGGPS konnte in einem ähnlichem Experiment die Funktion eines bislang nur postulierten Aminosäurerestes als essentiell für die Begrenzung der Substratlänge und damit der Spezifität von afGGGPS belegt werden.
Um das native Substrat und das Produkt von PcrB in B. subtilis zu bestimmen wurden Inkorporationsversuche mit 14C-G1P durchgeführt. Verglichen wurde dabei der B. subtilis Wildtyp Stamm und ein genomischer knockout Stamms ΔpcrB. Nach Extraktion und Analyse über Dünnschichtchromatographie konnten drei mögliche hydrophobe Produkte von PcrB identi¬fiziert werden. Zur Steigerung der Signalstärke wurde pcrB in B. subtilis rekombinant exprimiert, über HPLC die drei Produkte nichtradioaktiv präpariert und über Massen¬spektrometrie und NMR-Spektroskopie identifiziert.
Es konnte C35-Heptaprenylglycerinphosphat als das native Reaktionsprodukt von PcrB bestimmt werden. In der Zelle liegt dieses dephosphoryliert und zum Teil einfach bzw. doppelt acetyliert vor. Die entsprechende Prozessierung wird über zwei weitere, noch nicht näher charakterisierte Proteine geleistet. Über Zellfraktionierung wurde die Lokalisation der Produkte in der Zellmembran von B. subtilis nachgewiesen. Mit Hilfe von moleküldynamischen Rechnungen konnte eine Theorie für die Spezifität von PcrB für das Substrat Heptaprenylpyrophosphat formuliert werden. Diese geht von einer Fixierung des planaren Endes des Substrates über Stapelkräfte an ein spezifisches Tyrosin am Ende der Bindetasche aus.
Zusammenfassend konnte damit zum ersten Mal Polyprenyl-Glycerin-1-Phosphat-Ether außerhalb der Domäne der Archaea nachgewiesen. Gestützt auf Sequenzvergleiche und in vitro Versuche ist davon auszugehen, dass die Ergebnisse auch auf die PcrB Enzyme anderer gram-positiver Bacillales zu übertragen sind. Eine mögliche Funktion der gefunden Heptaprenylglycerinderivate könnte in der Regulation der Membranrigidität oder der Adhäsion der Organismen an Oberflächen liegen. Diese Hypothesen sollen nun in Zusammenarbeit mit mikrobiologisch orientierten Arbeitsgruppen überprüft werden.
Translation of the abstract (English)
Latest developments in sequencing methods allow the deciphering of a bacterial genome within a few days. As a consequence one of the most important challenges of the beginning post-genomic era is the assignment of functions to the identified genes and gene products. In this study an integrative approach to elucidate enzyme functions through a combination of bioinformatics, genetics and ...
Translation of the abstract (English)
Latest developments in sequencing methods allow the deciphering of a bacterial genome within a few days. As a consequence one of the most important challenges of the beginning post-genomic era is the assignment of functions to the identified genes and gene products.
In this study an integrative approach to elucidate enzyme functions through a combination of bioinformatics, genetics and microbiology and the analytical techniques of physical biochemistry was featured. The (βα)8-barrel protein PcrB from Bacillus subtilis was chosen as a candidate for a functional analysis. The protein bears high similarity to a key enzyme of the archaeal membrane lipid synthesis, geranylgeranylglycerol phosphate synthase (GGGPS), which catalyzes the stereospecific condensation of geranylgeranyl pyrophosphate (GGPP) and glycerol 1-phosphate (G1P).
In comparative studies the crystal structures of PcrB and GGGPS from Archaeoglobus fulgidus (afGGGPS) and G1P could be derived as one substrate also of PcrB. The protein AraM was identified as glycerol 1-phosphate dehydrogenase producing G1P in B. subtilis. A assay with radiolabeled G1P was established in order to investigate PcrB’s activity both in vitro and in vivo.
Therefore 14C-glucose was processed by the enzymes of the first part of glycolysis to dihydroxyacetone phosphate and AraM was used to produce 14C-G1P stereo specifically. G1P-dependent GGGPS activity of PcrB was tested and could be verified. The enzyme also accepted in vitro longer polyprenyl pyrophosphate ¬ (C25-C30) - than the previously tested C20-GGPP as substrate.
The postulated importance of an amino acid residue in afGGGPS in limiting the substrate length was confirmed experimentally.
Incorporation assays with 14C-G1P were started to identify the native substrate of PcrB in B. subtilis. Therefore, a culture of a genomic knockout strain ΔpcrB was incubated with 14-C labeled G1P and compared with wild-type B. subtilis. Three potential hydrophobic products were identified. To increase the signal strength and the amount of labeled products PcrB was expressed in B. subtilis recombinantly. The three products were prepared via HPLC in a labeled and a non labeled way and were analyzed via mass spectrometry and NMR spectroscopy.
C35-heptaprenylglycerin phosphate was determined as the reaction product of PcrB. In vivo two yet to be identified enzymes catalyze the dephosphorylation and partially acetylation of heptaprenylglycerin phosphate. Cell fractionation experiments showed the localization of these products in the cell membrane of B. subtilis.
So, for the first time, polyprenyl-1-glycerol ether lipids were identified outside the domain of Archaea. Based on further sequence comparisons and in vitro experiments it is likely that the results can be transferred to the PcrB enzymes of other gram-positive Bacillales. A possible function of the displayed heptaprenylglycerinderivate may lie in the regulation of membrane rigidity and the adhesion of organisms to surfaces. These hypotheses should now be reviewed in cooperation with microbiology-oriented working groups.
Metadata last modified: 26 Nov 2020 08:00
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