| License: Publishing license for publications including print on demand (5MB) |
- URN to cite this document:
- urn:nbn:de:bvb:355-epub-190621
- DOI to cite this document:
- 10.5283/epub.19062
| Item type: | Thesis of the University of Regensburg (PhD) |
|---|---|
| Open Access Type: | Primary Publication |
| Date: | 17 January 2011 |
| Referee: | Prof. Dr. Armin Buschauer and Prof. Dr. Günther Bernhardt |
| Date of exam: | 16 December 2010 |
| Institutions: | Chemistry and Pharmacy > Institute of Pharmacy > Pharmaceutical/Medicinal Chemistry II (Prof. Buschauer) |
| Interdisciplinary Subject Network: | Not selected |
| Keywords: | Durchflusszytometrie, Fluoreszenzligand, Radioligand, G-Protein gekoppelter Rezeptor, Histaminrezeptor, Quadratsäureamid, GPCR, Histamine, pharmacological tools, Piperidinomethylalkylamine, flow cytometry, fluorescent ligand, H2-receptor, H3-receptor, structure-activity relationship, squaramide |
| Dewey Decimal Classification: | 500 Science > 540 Chemistry & allied sciences |
| Status: | Published |
| Refereed: | Yes, this version has been refereed |
| Created at the University of Regensburg: | Yes |
| Item ID: | 19062 |
Abstract (English)
Histamine receptors, as typical aminergic G-protein coupled receptors (GPCRs), are subject of an extensive research project in our laboratory, aiming at receptor subtype (H1R, H2R, H3R, H4R) selective agonists and antagonists. The H2-receptor (H2R) plays a key role in gastric acid secretion, and H2R antagonists revolutionized the treatment of peptic ulcer/gastric acid related diseases. ...
Abstract (English)
Histamine receptors, as typical aminergic G-protein coupled receptors (GPCRs), are subject of an extensive research project in our laboratory, aiming at receptor subtype (H1R, H2R, H3R, H4R) selective agonists and antagonists. The H2-receptor (H2R) plays a key role in gastric acid secretion, and H2R antagonists revolutionized the treatment of peptic ulcer/gastric acid related diseases. Antagonists targeting the H3-receptor (H3R) are potential drugs for the treatment of CNS disorders, such as sleep and wake disorders or schizophrenia.
To extend our knowledge about structure-activity/selectivity relationships this work aimed at the synthesis and pharmacological characterization of novel histamine H2R and H3R ligands, taking the development of radiolabelled or fluorescent pharmacological tools into account. Additionally, a bivalent ligand approach was explored. The compounds were investigated in steady state GTPase assays on membranes of Sf9 cells expressing the human (or guinea pig) receptor subtype of interest and in radioligand binding studies on Sf9 cell membranes or HxR expressing mammalian cells. In addition, fluorescence based methods, such as calcium assays, flow cytometry and confocal microscopy were applied.
Histamine H2R antagonists: In a first series of H2R antagonists the “urea equivalent” (e.g. cyanogua-nidine group) in piperidinomethylphenoxyalkylamine-type compounds, derived from potentidine, was replaced by squaramides, amides and nitroethenediamine moieties and/or coupled to ω-aminoalkyl spacers. By analogy, cimetidine- and tiotidine-like compounds were synthesized. Potentidine-related compounds were potent antagonists with high selectivity for the H2R over the H1R and H4R, but with moderate selectivity compared to the H3R. Highest H2R antagonist activity was identified for aminoalkyl-substituted squaramides (Kb’-values ranging from 1 to 200 nM) with improved selectivity versus the H3R by elongation of the alkyl spacers. Bivalent ligands such as N2-[3-(3-piperidin-1-ylmethylphenoxy)propyl]squaric diamides, dimerized by alkanediyl spacers of different length attached to N1, had H2R antagonistic potencies in the one-digit nanomolar range. Highest H2R selectivity was obtained with 8- and 10-membered alkyl chains. Coupling of the N1-(6-aminohexyl)-substituted squaramide to [2,3-3H]propionic acid yielded a new highly potent tritiated H2R antagonist, [3H]UR-DE257 [2,3-3H]-N-(6-(3,4-dioxo-2-(3-(3-(piperidin-1-ylmethyl)phenoxy)propylamino)-cyclobut-1-enylamino)hexyl)propanamide (Kd saturation: 27 nM), which was successfully applied for the determination of H2R ligand affinities in competition binding experiments. Aiming at fluorescent ligands amine precursors from the H2R antagonist series were employed and linked to different fluorophores (cyanine, bodipy and pyrylium dyes). The most potent compounds (Kb’ -values 20 - 200 nM) were successfully applied in confocal microscopy and flow cytometric binding studies (saturation and competition binding).
Histamine H3R antagonists: The same approach as for radio- and fluorescence-labelled H2R antagonists was applied to H3R ligands, using para-(piperidinomethyl)phenoxyalkylamine-type building blocks related to potent H3R antagonists (e.g. JNJ5207852). Modifications by introduction of flexible alkylamine spacers, aminopiperidines, squaramides, 4-F-benzoic and propionic acid residues were carried out. One of the p-F-benzamide derivatives turned out to be a potent H3R antagonist (Kb’ 5.2 nM) and a putative lead compound for the development of PET ligands. Squaramides were moderately selective for the H3R over the H2R. Reduced selectivity was also characteristic of squaramide-type H2R antagonists. Thus, the squaramide residue was identified as a moiety conferring affinity to both histamine receptors and accounting for the loss of selectivity. Coupling of fluorophores to the primary amines of the H3R antagonists resulted in compounds with partly increased activity at the receptor compared to the parent compound. Selected potent compounds (Kb’ 5 - 20 nM) proved to be suitable for the determination of H3R binding constants by flow cytometry and for application in confocal microscopy.
In conclusion, the structural modifications of the piperidinomethylphenoxyalkylamine motif provided potent H2R and H3R antagonists and new insights into structure-activity/selectivity relationships. The new fluorescent probes enable fluorescence based investigations to identify new H2R or H3R ligands and are useful tools for more detailed pharmacological investigations (detection of receptor subtypes on cells/in tissues). A straightforward approach to the preparation of radiolabelled compounds resulted in the new H2R radioligand [3H]UR-DE257 and paved the way to potential H3R PET ligands.
Translation of the abstract (German)
Histamin-Rezeptoren, typische aminerge G-Protein-gekoppelte Rezeptoren, sind Gegenstand eines umfangreichen Forschungsprojekts unserer Arbeitsgruppe, das auf Rezeptorsubtyp selektive (H1R, H2R, H3R, H4R) Agonisten und Antagonisten abzielt. Der H2-Rezeptor (H2R) spielt eine Schlüsselrolle in der Regulation der Magensäuresekretion; die Entwicklung von H2R-Antagonisten revolutionierte seinerzeit die ...
Translation of the abstract (German)
Histamin-Rezeptoren, typische aminerge G-Protein-gekoppelte Rezeptoren, sind Gegenstand eines umfangreichen Forschungsprojekts unserer Arbeitsgruppe, das auf Rezeptorsubtyp selektive (H1R, H2R, H3R, H4R) Agonisten und Antagonisten abzielt. Der H2-Rezeptor (H2R) spielt eine Schlüsselrolle in der Regulation der Magensäuresekretion; die Entwicklung von H2R-Antagonisten revolutionierte seinerzeit die Behandlung von Ulkuserkrankungen. Antagonisten des H3-Rezeptors sind potentielle Arzneistoffe für die Therapie von Erkrankungen des Zentralnervensystems, wie Störungen des Wach-Schlaf-Rhythmus oder Schizophrenien.
Das Ziel dieser Arbeit war die Synthese und Charakterisierung neuer H2R-und H3R-Liganden, unter Berücksichtigung der Entwicklung radioaktiv- oder fluoreszenzmarkierter pharmakologischer Werkzeuge, um das Wissen über Struktur- Aktivitäts/Selektivitäts-Beziehungen dieser Stoffklassen zu erweitern. Außerdem wurde ein Ansatz zur Entwicklung bivalenter Liganden erprobt. Die Substanzen wurden in GTPase-Assays an Membranen von Sf9-Zellen, die den entsprechenden Rezeptor des Menschen oder des Meerschweinchens exprimieren, und in Radioligandbindungsstudien an Sf9-Zellmembranen oder HxR-exprimierenden Säugerzellen untersucht. Zusätzlich wurden fluoreszenzbasierte Methoden wie Ca-Assays, Durchflusszytometrie und konfokale Mikroskopie angewandt.
H2R-Antagonisten: In der ersten Reihe von H2R-Antagonisten wurden das „Harnstoff-Äquivalent“ (z.B. Cyanoguanidin) der Piperidinomethylphenoxyalkylamin-artigen, von Potentidin abgeleiteten Verbindungen durch Quadratsäureamide, Amide oder Nitroethendiamine ersetzt und/oder mit ω-Aminoalkyl-Resten verknüpft. Analog wurden Cimetidin- und Tiotidin-ähnliche Substanzen synthetisiert. Von Potentidin abgeleitete Substanzen waren potente Antagonisten mit hoher Selektivität für den H2R, verglichen mit H1R und H4R, aber nur moderater Selektivität gegenüber dem H3R. Höchste Aktivität zeigten die Aminoalkyl-substituierten Quadratsäureamide (Kb’ 1 -200 nM), wobei sich die Selektivität gegenüber dem H3R durch Verlängerung des Alkyl-Linkers verbessern ließ. Bivalente Liganden (am N1 über Alkandiylreste zu Dimeren verknüpfte N2-[3-(3-Piperidin-1-ylmethylphenoxy)propyl]¬quadrat¬säure¬diamide) zeigten H2R-antagonistische Aktivität im einstelligen nanomolaren Bereich. Die höchste H2R-Selektivität wurde mit 8- und 10-gliedrigen Alkylketten erzielt. Kopplung des N1-(6-aminohexyl)-substituierten Quadratsäureamids mit [2,3-3H]Propionsäure ergab den hochaffinen tritiierten H2R Antagonisten [3H]UR-DE257 [2,3-3H]-N-(6-(3,4-dioxo-2-(3-(3-(piperidin-1-ylmethyl)phenoxy)propylamino)cyclobut-1-enylamino)hexyl)propanamid (Kd Sättigung: 27 nM), der sich zur Bestimmung der Affinitäten von H2R-Liganden in Kompetitionsexperimenten eignete. Fluoreszenzliganden wurden aus Aminvorstufen der H2R-Antagonisten durch Kopplung an verschiedene Fluorophore (Cyanin-, Bodipy- und Pyrylium-Farbstoffe) erhalten. Die potentesten Substanzen (Kb’ 20 - 200 nM) wurden erfolgreich in der Konfokalmikroskopie und in durchflusszytometrischen Bindungsstudien (Sättigung und Kompetition) eingesetzt.
H3R-Antagonisten: Der für die Synthese von H2R Radio- und Fluoreszenzliganden erfolgreiche Ansatz ließ sich auf H3R-Liganden übertragen. Dazu wurden para-(Piperidinomethyl)-phenoxyalkylamin-artige Synthesebausteine verwendet, die sich von potenten H3R-Antagonisten (z.B. JNJ5207852) ableiten. Strukturvariationen bestanden in der Einführung flexibler Alkylamin-Gruppen, Aminopiperidine, Quadratsäureamide, 4-F-Benzoesäure- oder Propionsäurereste. Eines der p-Fluorbenzamide erwies sich als potenter H3R-Antagonist (Kb’ 5.2 nM) und könnte als Leitstruktur zur Entwicklung von PET-Liganden dienen. Die Quadratsäureamide wiesen nur mäßige Selektivität für den H3R gegenüber dem H2R auf, was die Ergebnisse zu den H2R-Antagonisten erhärtet: die Quadratsäureamidgruppe erhöht die Affinität zu beiden Histamin-Rezeptoren und bedingt den Selektivitätsverlust. Die Kopplung von Fluorophoren an die primäre Aminfunktion der H3R-Antagonisten führte teilweise zur Aktivitätssteigerung verglichen mit den Ausgangssubstanzen. Ausgewählte Substanzen mit hoher H3R-antagonistischer Aktivität (Kb’ 5 - 20 nM) eigneten sich zur Bestimmung von H3R-Bindungskonstanten mittels Durchflusszytometrie und für die Konfokalmikroskopie.
Insgesamt lieferten die strukturellen Veränderungen des Piperidinomethylphenoxyalkylamin-Motivs potente H2R- und H3R-Antagonisten und neue Einblicke in die Struktur-Aktivitäts-/Selektivitäts-Beziehungen. Die synthetisierten fluoreszierenden Substanzen ermöglichen fluoreszenzbasierte Untersuchungen zur Identifizierung neuer H2R- oder H3R-Liganden und stellen wertvolle Werkzeuge für detaillierte pharmakologische Untersuchungen dar (Detektion von Rezeptor-Subtypen auf Zellen und in Geweben). Der zur Synthese radioaktiv markierter Substanzen verfolgte Ansatz führte zu dem neuen Radioliganden [3H]UR-DE257 und zeigt einen Weg zu potentiellen PET-Liganden für den H3R auf.
Metadata last modified: 26 Nov 2020 07:39
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