Analysis of intermediates of the methionine and polyamine metabolism by liquid chromatography-tandem mass spectrometry

Item type:	Thesis of the University of Regensburg (PhD)
Date:	5 August 2011
Referee:	Prof. Dr. Frank-Michael Matysik and Prof. Dr. Peter Oefner
Date of exam:	29 June 2011
Institutions:	Chemistry and Pharmacy > Institut für Analytische Chemie, Chemo- und Biosensorik > Instrumentelle Analytik (Prof. Frank-Michael Matysik) Medicine > Institut für Funktionelle Genomik > Lehrstuhl für Funktionelle Genomik (Prof. Oefner)
Interdisciplinary Subject Network:	Not selected
Keywords:	5’-Deoxy-5’-methylthioadenosine (MTA), methythioadenosine phosphorylase (MTAP), metabolomics, liquid chromatography-tandem mass spectrometry, methionine and polyamine pathways, Metabolomics, Flüssigchromatographie-Tandemmassenspektrometrie, Methionin- und Polyaminstoffwechselwege
Dewey Decimal Classification:	500 Science > 540 Chemistry & allied sciences
Status:	Published
Refereed:	Yes, this version has been refereed
Created at the University of Regensburg:	Yes
Item ID:	21395

Abstract (English)

5’-Deoxy-5’-methylthioadenosine (MTA) is formed in the course of the synthesis of polyamines from S-adenosylmethionine (SAM). Tumors lack the enzyme methylthioadenosine phosphorylase (MTAP), which metabolizes MTA, and should accumulate MTA. In a first step, a method for quantification of MTA by liquid chromatography-mass spectrometry was developed and the postulated accumulation of MTA in tumors ...

Abstract (English)

5’-Deoxy-5’-methylthioadenosine (MTA) is formed in the course of the synthesis of polyamines from S-adenosylmethionine (SAM). Tumors lack the enzyme methylthioadenosine phosphorylase (MTAP), which metabolizes MTA, and should accumulate MTA. In a first step, a method for quantification of MTA by liquid chromatography-mass spectrometry was developed and the postulated accumulation of MTA in tumors and tumor cell lines lacking MTAP could be demonstrated. To elucidate further consequences of a lack of MTAP in tumor cells, the method was expanded to most of the metabolites in the methionine and polyamine pathways. With this method it could be shown, that MTA, putrescine and SAM correlate in concentration. So, the accumulation of MTA has a direct influence on the synthesis of the polyamines. This correlation could be observed in different tumor species, e.g. malignant melanoma, HCC, renal carcinoma and brain tumors, as well as in different liver diseases (fibrosis, cirrhosis and hepatocellular carcinoma). To clarify a relation between MTA concentration and MTAP abundance a mass spectrometry based activity-assay for MTAP has been set up, using stable isotope labeled MTA as substrate. The decrease in stable isotope labeled MTA was measured over time by liquid chromatography-mass spectrometry and rate constants were determined. For mice with fatty liver disease an inverse correlation of MTA concentration and MTAP activity (both normalized to tissue weight) was observed. The assay works also in human tumor biopsies, but the analysis of the results is much more difficult because the control tissue is cirrhotic. Normalization to tissue weight is not possible due to the different nature of both tissue specimens.
In a next step MTAP protein should be quantified by AQUA peptides and liquid chromatography mass spectrometry for a better understanding of the still measured activity.

Translation of the abstract (German)

5’-Deoxy-5’-methylthioadenosin (MTA) entsteht im Zuge der Polyaminsynthese aus S-Adenosylmethionin (SAM). Das für den Abbau von MTA nötige Enzym Methylthioadenosinphosphorylase (MTAP) ist in vielen Tumoren nicht vorhanden oder zumindest in seiner Aktivität stark vermindert und somit wird postuliert, dass in Tumoren MTA akkumuliert. Zuerst wurde eine Methode zur quantitativen Bestimmung von MTA ...

Translation of the abstract (German)

5’-Deoxy-5’-methylthioadenosin (MTA) entsteht im Zuge der Polyaminsynthese aus S-Adenosylmethionin (SAM). Das für den Abbau von MTA nötige Enzym Methylthioadenosinphosphorylase (MTAP) ist in vielen Tumoren nicht vorhanden oder zumindest in seiner Aktivität stark vermindert und somit wird postuliert, dass in Tumoren MTA akkumuliert. Zuerst wurde eine Methode zur quantitativen Bestimmung von MTA mit Flüssigkeitschromatographie-Tandem-Massenspektrometrie entwickelt, mit der dann die vermutete Akkumulation von MTA in Tumoren und Tumor-Zell-Linien mit reduziertem MTAP-Level nachgewiesen werden konnte. Um weitere Folgen eines reduzierten MTAP-Levels in Tumoren zu klären, wurde die Methode auf die meisten Metabolite des Methionin- und Polyaminstoffwechselweges erweitert und es konnte gezeigt werden, dass eine positive Korrelation zwischen MTA, SAM und Putrescin besteht, die sowohl in verschiedenen Tumoren (z. B. Melanom, Gliom, Nierenkarzinom und Lebertumor) als auch unterschiedlichen Lebererkrankungen (Fettleber, Zirrhose und Lebertumor) beobachtet werden konnte. Zur Klärung des Zusammenhangs zwischen MTA-Konzentration und Menge an MTAP wurde ein Aktivitäts-Assay für MTAP entwickelt, bei dem stabil isotopen markiertes MTA verwendet wurde. Die zeitliche Abnahme des Substrates wurde mit Flüssigkeitschromatographie-Tandem-Massenspektrometrie verfolgt und Geschwindigkeitskonstanten ermittelt. Bei Mäusen mit Fettleber konnte eine inverse Korrelation von MTA-Konzentration und MTAP-Aktivität (normalisiert auf Lebergewicht) beobachtet werden. Somit akkumuliert MTA in den Lebern der kranken Mäuse auf Grund eines langsameren MTA-Abbaus. In humanem Lebergewebe, welches mit diesem Assay ebenfalls analysiert wurde, sind die Ergebnisse schwerer zu interpretieren, da das Kontrollgewebe in diesem Fall bereits zirrhotisch ist. Eine Normalisierung auf Gewicht ist auf Grund des großen Unterschiedes zwischen gesundem und zirrhotischem Lebergewebe nicht sinnvoll.
In einem nächsten Schritt soll die MTAP-Proteinmenge mit AQUA-Peptiden und Flüssigkeitschromatographie-Tandem-Massenspektrometrie bestimmt werden, um die gewonnenen Aktivitätswerte besser verstehen zu können.

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