| License: Publishing license for publications excluding print on demand (46MB) |
- URN to cite this document:
- urn:nbn:de:bvb:355-epub-214904
- DOI to cite this document:
- 10.5283/epub.21490
| Item type: | Thesis of the University of Regensburg (PhD) |
|---|---|
| Place of Publication: | Regensburg |
| Number of Pages: | 371 |
| Date: | 11 January 2012 |
| Referee: | Prof. Dr. Joachim Wegener and Prof. Dr. Otto S. Wolfbeis and Prof. Dr. Achim Göpferich |
| Date of exam: | 5 July 2011 |
| Institutions: | Chemistry and Pharmacy > Institut für Analytische Chemie, Chemo- und Biosensorik > Bioanalytik und Biosensorik (Prof. Joachim Wegener) |
| Keywords: | Elektroporation, Impedanzanalyse, adhärente Zellen / electroporation, impedance analysis, adherent cells |
| Dewey Decimal Classification: | 500 Science > 540 Chemistry & allied sciences |
| Status: | Published |
| Refereed: | Yes, this version has been refereed |
| Created at the University of Regensburg: | Yes |
| Item ID: | 21490 |
Abstract (English)
This work addresses the electric manipulation, i.e. electroporation or electrofusion, of anchorage-dependent mammalian cells and the subsequent analysis of the cellular response using a well-established impedimetric biosensor (ECIS). Cells were grown to confluence on planar gold-film electrodes, which were used for the application of invasive electric AC pulses as well as for the non-invasive ...
Abstract (English)
This work addresses the electric manipulation, i.e. electroporation or electrofusion, of
anchorage-dependent mammalian cells and the subsequent analysis of the cellular response
using a well-established impedimetric biosensor (ECIS). Cells were grown to confluence on
planar gold-film electrodes, which were used for the application of invasive electric AC
pulses as well as for the non-invasive impedimetric monitoring of the cell layer response.
The first part of this work deals with the electroporation-assisted delivery of different classes
of membrane-impermeable bioactive probes into various types of anchorage-dependent
mammalian cells and the analysis of cell morphology changes by non-invasive impedance
measurements. Optimal pulse parameters for electroporation of different adherent cell lines
(NRK-52E, HEK-293, Hep G2, CHO, NIH-3T3) were obtained from dye loading studies with
high molecular weight FITC-dextran in combination with impedance monitoring of cell layer
recovery kinetics. The cell lines showed an individual impedance profile after application of
the electroporation pulse. Impedance measurements with a high time resolution and timelapse
CLSM recordings revealed that within ~ 5 s after electroporation the membrane is
resealed while the uptake of 250 kDa FITC-dextran is completed after ~ 3 s. Post-pulse
impedance changes recorded over about 1 h after electroporation have been ascribed to
changes in cell morphology. Electroporation of NRK cells in presence of membrane-impermeable
cytotoxic molecules (azide, bleomycin, cytochrome c) changed the cellular
impedance response profile, depending on the individual mechanism of cytotoxicity.
Accompanying live/dead assays confirmed the impedimetric readout.
The experimental setup for electric manipulation and sensing was further optimized to allow
for economic use of costly bioactive macromolecules, like enzymes, antibodies or nucleic
acids in electroporation-assisted delivery. The miniaturized setup requires only sample
volumes of less than 30 μl without influencing the loading efficiency or the quality of the
ECIS measurement. After optimization of the electroporation parameters for different cell
types the miniaturized microelectrode setup was used to monitor the cell layer response after
loading with cytochrome c, DNase I and RNase A. Intracellular delivery of antibodies,
nucleic acids and nanoparticles was proven by fluorescence microscopy. NRK and Hep G2
cells were loaded with antibodies that specifically bound to their intracellular epitopes
ß-catenin, occludin and ZO-1, respectively. The in situ electroporation of adherent cells
(NRK, Hep G2, HEK-293) in presence of plasmid DNA or a linear DNA fragment encoding
fluorescent reporter genes resulted in cell type-dependent transfection efficiencies between
10 % and 70 %. Moreover, NRK cells were efficiently loaded with PEGylated core-shell
CdSe/ZnS quantum dots, resulting in a homogeneous cytoplasmic distribution of the probe.
The second part of this work was devoted to the use of substrate-integrated planar gold-film electrodes to induce and detect cell fusion. The electroporation of HEK-293 cells in presence of polyethyleneimine (PEI) coated iron oxide particles designed for transfection (PolyMAG)
led to a considerable cell fusion and the formation of polynucleate giant cells on the ECIS
electrode. Multi-cell fusion was proven by specific cytochemical stainings as well as by
fusing genetically engineered cell lines expressing fluorescent cytoplasmic (HEK-EGFP,
HEK-ECFP) or membrane proteins (HEK-EYFP/pAbcg2). The process of multi-cell fusion
was monitored electrically by ECIS readings at 4 kHz with a time resolution down to 0.6 min.
Cell fusion was dependent on the HEK cell line. The experimentally obtained impedance
spectra correlated well with those from theoretical simulations and provided an estimate for
the average number of fused cells. Since the average number of fused cells is only an estimate
for fusion efficiency, the impedance magnitude at 4 kHz was taken to evaluate different
parameters, like electric pulse parameters and fusogenic additives, for their impact on cell
fusion. Electric pulsing of cells in presence of negatively charged polymers and polystyrene
particles did not induce fusion. In contrast, cationic soluble polymers like PEI and poly-L-lysine
were shown to induce multi-cell fusion after electroporation, whereas amine modified
cationic polystyrene nanoparticles had no fusogenic effect. Taken together, the fusogenic
effect of PolyMAG particles in combination with electric pulsing has been ascribed to its
polycationic and flexible PEI coat.
Translation of the abstract (German)
Die elektrische Manipulation adhärenter Zellen auf leitfähigen Substraten in situ und die anschließende Analyse der Zellantwort mittels Impedanzspektroskopie (ECIS) standen im Vordergrund dieser Arbeit. Dazu wurden konfluente Zellschichten auf planaren Gold-Film Elektroden kultiviert, die zugleich zur Applikation invasiver AC Pulse und zur nichtinvasiven Impedanzanalyse für die Dokumentation der ...
Translation of the abstract (German)
Die elektrische Manipulation adhärenter Zellen auf leitfähigen Substraten in situ und die
anschließende Analyse der Zellantwort mittels Impedanzspektroskopie (ECIS) standen im
Vordergrund dieser Arbeit. Dazu wurden konfluente Zellschichten auf planaren Gold-Film
Elektroden kultiviert, die zugleich zur Applikation invasiver AC Pulse und zur nichtinvasiven
Impedanzanalyse für die Dokumentation der Zellantwort genutzt wurden.
Der erste Teil der Arbeit beschäftigte sich mit dem durch in situ Elektroporation vermittelten
Transfer diverser bioaktiver Moleküle in adhärente Zellen und der Analyse von
Zellmorphologieänderungen mit Hilfe von Zellform-sensitiven Impedanzmessungen.
Für konfluente Schichten verschiedener adhärenter Zelllinien (NRK, HEK-293, Hep G2,
CHO, NIH-3T3) wurden die Elektroporationsbedingungen so optimiert, dass eine Beladung
nahezu aller Zellen auf der Elektrode mit dem Indikator-Molekül FITC-Dextran (250 kDa)
erfolgte, ohne dass eine irreversible Schädigung auftrat, wie anhand kontinuierlicher
Impedanzmessungen nachgewiesen wurde. Als Antwort auf einen Elektroporationspuls
reagieren konfluente Zellschichten verschiedener Zelllinien mit einem individuellen,
zelltypischen Impedanzprofil. Impedanzmessungen mit hoher zeitlicher Auflösung zeigten,
dass die Membranintegrität nach elektrischer Permeabilisierung innerhalb nur weniger
Sekunden wieder hergestellt ist. Zeitaufgelöste CLSM Aufnahmen bestätigten, dass eine
intrazelluläre Akkumulation von 250 kDa FITC-Dextran nur innerhalb der ersten 3 s nach
einer Elektroporation erfolgte. Die bis zu 1 h andauernden Impedanzänderungen nach
Elektroporation können daher auf Änderungen in der Zellmorphologie zurückgeführt werden.
Das zelltypische Impedanzprofil nach Applizierung eines Elektroporationspulses kann
innerhalb des Regenerationszeitraumes von etwa 1 h durch Zellreaktionen auf eingetragene,
bioaktive Moleküle verändert oder überlagert werden. Das kleine anorganische Azid Ion, das
Glykopeptid-Antibiotikum und Elektrochemotherapeutikum Bleomycin sowie der
Apoptoseauslöser Cytochrom c wurden mittels in situ Elektroporation in das Cytoplasma von
NRK Zellen eingetragen. Als Antwort auf diese cytotoxisch wirkenden Moleküle konnte
mittels kontinuierlicher ECIS Messungen eine Abnahme der Impedanz dokumentiert werden,
welche in Abhängigkeit vom Wirkmechanismus der jeweiligen Substanz zeitlich versetzt zum
Eintrag in die Zelle einsetzte. Unterstützend zu den Impedanzprofilen gaben zellbiologische
Färbungen mit DAPI, EthD-1 und CaAM Hinweise darauf, dass Bleomycin und Cytochrom c
in NRK Zellen Apoptose induzieren.
Nach grundsätzlicher Validierung des kombinierten Elektroporations- und Sensorsystems
wurde der experimentelle Aufbau für einen ökonomischen Eintrag kostenintensiver und
aufwändig zu präparierender Proben miniaturisiert. Es wurde ein spezielles Elektrodenlayout
entwickelt, welches es erlaubt, in einem Probenvolumen von nur 30 μl effizient zu
elektroporieren und über 70 h stabil zu messen. Das miniaturisierte in situ Elektroporations- und
Impedanzsystem wurde genutzt, um bioaktive Proteine wie Cytochrom c, RNase A und
DNase I in das Cytoplasma von NRK Zellen einzutragen und deren Einfluss auf die
Zellregeneration mit Hilfe nicht-invasiver Impedanzmessungen zu untersuchen. Da der Substanzeintrag mittels in situ Elektroporation in Kombination mit der nicht-invasiven
kontinuierlichen Impedanzmessung ein enormes Potential für die Untersuchung von Gen- und
Proteinaktivitäten bedeutet, wurde die Beladung von Zellen mit Antikörpern, codierender
DNA und Nanopartikeln fluoreszenzmikroskopisch untersucht. NRK Zellen konnten mit
hoher Effizienz mit Antikörpern beladen werden, welche die intrazellulären Epitope
ß-Catenin, Occludin und ZO-1 spezifisch binden. Die in situ Elektroporation von NRK,
Hep G2 und HEK-293 Zellen mit codierender Plasmid- oder Fragment-DNA führte in
Abhängigkeit der verwendeten Zelllinie zur Expression der fluoreszenten Reporterproteine
mit Effizienzen zwischen 10 % und 70 %. Die Elektroporation von NRK Zellen in Gegenwart
von Quantum Dot Nanopartikeln führte zu einer homogenen cytoplasmatischen Beladung mit
Partikeln.
Der zweite Teil dieser Arbeit beschäftigte sich mit der Verwendung des ECIS basierten
Elektromanipulations- und Sensorsystems zur Detektion von Zellfusionsereignissen in situ.
Die Elektroporation von HEK-293 Zellen in Gegenwart von zur Transfektion konzipierten,
Polyethylenimin (PEI) beschichteten magnetischen Eisenoxid-Nanopartikeln (PolyMAG)
führte zur Fusion der Zellmembranen und zur Ausbildung von polynukleären Synzytien auf
der Elektrodenoberfläche. Die Fusion von HEK Zellen konnte nach spezifischer Anfärbung
der Membranen, des Cytoplasmas oder des extrazellulären Raumes mikroskopisch
nachgewiesen werden. Insbesondere die rekombinante Zellinie HEK-EYFP/pAbcg2
ermöglichte aufgrund ihrer intrinsischen Fluoreszenzmarkierung eine optimale
mikroskopische Erfassung von Änderungen in der Membranverteilung während und nach
dem Fusionsprozess. Darüber hinaus konnte der Zellfusionsprozess mit Hilfe von
Impedanzmessungen bei 4 kHz mit einer zeitlichen Auflösung von bis zu 0.6 min verfolgt
werden. Die Effektivität der Zellfusion erwies sich als abhängig von der eingesetzten HEK
Zelllinie. Die Etablierung eines Modells auf Basis sich durch Fusion verändernder
Zellparameter ermöglichte es, die Fusion von HEK Zellen auf ECIS Elektroden zu simulieren.
Eine gute Übereinstimmung simulierter und experimenteller Spektren erlaubte eine
Abschätzung der Zahl der im Mittel fusionierten Zellen. Für die Untersuchung der
Fusionseffizienz bei Variation experimenteller Parameter, wie Einstellungen des
Elektroporationspulses oder Verwendung fusogener Additive, wurde der Anstieg der
Impedanz als quantitativer Indikator verwendet. Dadurch konnte sowohl die Bedeutung des
elektrischen Pulses als Initiator für den Fusionsprozess als auch die entscheidende Fusionsfördernde
Eigenschaft der PEI beschichteten PolyMAG Partikel aufgeklärt werden. Mit Fokus
auf die chemischen Oberflächeneigenschaften der Partikel wurden Polystyrol Nanopartikel
sowie verschiedene lösliche Polymere mit unterschiedlicher Oberflächenladung in Bezug auf
ihre fusogenen Eigenschaften während der Elektropermeabilisierung untersucht. Neutrale
oder negativ geladene Polymere und Partikel hatten keinen fusogenen Effekt.
Polykationische, lösliche Polymere, wie PEI und PLL, induzierten einen starken Anstieg der
Zellschichtimpedanz nach Pulsapplikation, wohingegen Amin-funktionalisierte Polystyrol
Nanopartikel nicht zu einer Fusion der Zellen führten. Somit ließ sich schließlich die fusogene
Wirkung der PolyMAG Partikel auf ihre polykationische und flexible Hülle aus PEI
zurückführen.
Metadata last modified: 26 Nov 2020 06:22
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