| License: Publishing license for publications excluding print on demand (2MB) |
- URN to cite this document:
- urn:nbn:de:bvb:355-epub-215415
- DOI to cite this document:
- 10.5283/epub.21541
| Item type: | Thesis of the University of Regensburg (PhD) |
|---|---|
| Open Access Type: | Primary Publication |
| Date: | 12 July 2012 |
| Referee: | Prof. Dr. Reinhard Sterner and Prof. Dr. Reinhard Wirth and Prof. Dr. Dr. Hans Robert Kalbitzer |
| Date of exam: | 29 June 2011 |
| Institutions: | Biology, Preclinical Medicine > Institut für Biophysik und physikalische Biochemie > Prof. Dr. Reinhard Sterner |
| Interdisciplinary Subject Network: | Not selected |
| Keywords: | zufällige Domänenkombination, Peptidoglykanhydrolase, Endolysin, Listeria |
| Dewey Decimal Classification: | 500 Science > 570 Life sciences 500 Science > 500 Natural sciences & mathematics |
| Status: | Published |
| Refereed: | Yes, this version has been refereed |
| Created at the University of Regensburg: | Yes |
| Item ID: | 21541 |
Abstract (German)
Endolysine degradieren das Peptidoglykan, wodurch die Bakterienzelle osmotisch destabilisiert wird und birst. Diese Enzyme sind äußerst spezifisch für bestimmte Bakterienarten und -gattungen, weshalb sie ein großes Potential für die gerichtete Eindämmung von Infektionskrankheiten darstellen und auf der Suche nach Lösungen für eine natürliche und gezielte Bekämpfung von pathogenen Bakterien ...
Abstract (German)
Endolysine degradieren das Peptidoglykan, wodurch die Bakterienzelle osmotisch destabilisiert wird und birst. Diese Enzyme sind äußerst spezifisch für bestimmte Bakterienarten und -gattungen, weshalb sie ein großes Potential für die gerichtete Eindämmung von Infektionskrankheiten darstellen und auf der Suche nach Lösungen für eine natürliche und gezielte Bekämpfung von pathogenen Bakterien zunehmend an Interesse gewinnen.
Endolysine sind modular aufgebaut, so dass sich die Funktionen der Zellbindung und der Hydrolyse distinkten Domänen zuweisen lassen. Durch die Bildung von Chimären können neue Moleküle mit veränderten Eigenschaften generiert werden. Somit lassen sich beispielsweise Substratspezifität, Lyseeffizienz, geringe Proteinstabilität oder die Aktivität in Gegenwart von interferierenden Substanzen verändern. Das Prinzip wird genutzt, um diese Proteine je nach gewünschten Eigenschaften für eine Anwendung zu modifizieren. Chimärenbildung erfolgte bisher über den aufwendigen rationalen Ansatz, einzelne Proteine zu entwerfen, zu klonieren und zu testen, wobei eine Vielzahl der Konstrukte nicht den Anforderungen entsprach.
Im Zuge dieser Arbeit sollte daher ein neuer Ansatz verfolgt werden, nämlich der zufälligen Kombination von Domänen aus Zellwand-Hydrolasen mit anschließendem Screening auf gewünschte Eigenschaften, so dass gezielt geeignete Moleküle identifiziert werden können. Dies erfolgte am Beispiel von Lysinen gegen Listeria. Listeria monocytogenes ist ein ernstzunehmender Lebensmittelpathogen, der durch seine Fähigkeit, in vakuumverpackten und gekühlten Lebensmitteln zu wachsen, nur schwer kontrollierbar ist. Der Zusatz eines listerienspezifischen Enzyms würde Kommensale und Nutzbakterien schonen und durch Eliminierung oder Inhibition des Krankheitserregers die Sicherheit von Lebensmitteln erhöhen.
Die angestrebte Strategie sah vor, verschiedene Domänen aus Zellwand-Hydrolasen zufällig miteinander zu Proteinen mit 2 und 3 Domänen zu kombinieren, wobei jede Domäne für jede mögliche Position zugelassen wird.
Hierfür wurde zunächst eine Klonierungsmethode entworfen und erfolgreich umgesetzt. Diese Methode umfasst eine zeitsparende Probenvorbereitung für die Erstellung positionsspezifischer DNA-Fragmente mit anschließender zufälliger Ligation an der Festphase.
Es wurden 2- und 3-Domänen Proteine generiert unter der Verwendung von 6 Zellbindedomänen aus Listerien-Endolysinen und 12 enzymatisch aktiven Domänen aus Endolysinen, Autolysinen, einem Bakteriozin und einem lytischen Phagenschwanzprotein mit verschiedenen Spezifitäten und Domänenmotiven.
Mehr als 1057 Varianten mit 2 Domänen und 15497 Varianten mit 3 Domänen wurden analysiert. Im initialen Schritt wurde generell auf Funktionsfähigkeit gegen ein Listerien-Serovar gescreent. Die anschließenden Testungen verfolgten das Ziel der späteren Anwendung im Lebensmittel, weshalb neben breiter Serovarspezifitiät auch auf Aktivität bei saurem pH, Toleranz von EDTA sowie Wachstumsinhibition von Listerien getestet wurde. Fünf selektierte chimäre Proteine wurden gereinigt und zusammen mit den Wildtyp-Endolysinen Ply511, PlyP40 und PlyP825 auf chemische, proteolytische und Temperatur-Stabilität, pH- und Salz-Optima, den Einfluss von EDTA auf die Enzymaktivität sowie minimale inhibitorische Konzentration und minimale bakterizide Konzentration untersucht. Als Beispiel für die Anwendung in einer sehr komplexen Lebensmittelmatrix wurde zudem die bakterizide Wirkung in Milch getestet.
Das beste gescreente Molekül war EcoGU3, eine Chimäre aus 3 Domänen, nämlich zwei enzymatischen aktiven Domänen mit verschiedenen Spezifitäten und einer mittigen Zellbindedomäne. EcoGU3 zeigte deutlich höhere Zellzahlreduktion in der Testung der minimalen bakteriziden Konzentration im Vergleich zu den untersuchten Wildtyp-Proteinen.
In zukünftigen Arbeiten soll dieses Protein für die Anwendung in einer komplexen Lebensmittelmatrix optimiert werden.
Translation of the abstract (English)
Endolysins degrade peptidoglycan and lead to osmotic destabilization and hence disruption of the bacterial cell. They are very specific for particular bacteria and as they have a high potential for reducing infectious diseases they are attracting increasing attention for a natural and targeted combat of pathogen bacteria. Endolysins have a modular structure and the functions of cell binding and ...
Translation of the abstract (English)
Endolysins degrade peptidoglycan and lead to osmotic destabilization and hence disruption of the bacterial cell. They are very specific for particular bacteria and as they have a high potential for reducing infectious diseases they are attracting increasing attention for a natural and targeted combat of pathogen bacteria.
Endolysins have a modular structure and the functions of cell binding and hydrolysis are located in distinct protein domains. The generation of protein chimaeras allows the creation of new molecules with modified properties. Thus, substrate specificity, lysis efficiency, protein stability or activity in presence of interfering substances can be optimized. Until now, it has been a laborious, rational approach to generate chimaeras. This comprises the design, cloning and testing of individual molecules. However, a multitude of constructs didn’t fulfill the requirements.
The purpose of this work was to develop a new approach for the identification of appropriate molecules by random combination of domains derived from cell wall hydrolases followed by subsequent screening for the desired properties. This was done exemplarily with lysins targeting Listeria. Listeria monocytogenes is a serious food borne pathogen and is hardly controllable due to its capability to even grow in vacuumed, refrigerated food. The addition of a Listeria specific enzyme could spare commensal and useful bacteria and increase food safety by elimination or inhibition of this pathogen.
The envisioned strategy comprised the random combination of multiple domains from different cell wall hydrolases to assemble proteins out of 2 and 3 domains, where every domain is allowed at every position.
The designed cloning strategy consisted of a time-saving sample preparation for the amplification of position specific DNA fragments, followed by ligation on solid phase at random.
2- and 3-domain proteins were generated out of 6 cell binding domains of Listeria endolysins and 12 enzymatic active domains of endolysins, autolysins, one bacteriocin, and a lytic phage tail protein with different specificities and domain motives.
More than 1057 variants with 2 domains and 15497 variants with 3 domains were analyzed. The initial screening step tested for lytic activity against one Listeria serovar. The subsequent screening was designed to select for favourable features in food applications: broad serovar specificity, activity at acidic pH, tolerance of EDTA, and Listeria growth inhibition. Finally, five chimeric proteins were selected and purified. Together with the wildtype endolysins Ply511, PlyP40, and PlyP825 chemical, proteolytic and temperature stability, optima of pH and NaCl, the influence of EDTA on enzyme activity as well as the minimum inhibitory concentration and minimum bactericidal concentration were determined. Furthermore, as an example for the application in a very complex food matrix the bactericidal efficacy in milk was tested.
The best screened molecule was EcoGU3, a chimaera consisting of three domains, two enzymatic active domains with different specificities and one central cell binding domain. EcoGU3 showed considerably higher numbers of cell reduction in the analysis of the minimum bactericidal concentration compared to the three wildtype proteins. A future prospect is to further optimize this protein for the application in a complex food matrix.
Metadata last modified: 25 Nov 2020 15:23
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