| Lizenz: Veröffentlichungsvertrag für Publikationen ohne Print on Demand (24MB) |
- URN zum Zitieren dieses Dokuments:
- urn:nbn:de:bvb:355-epub-219609
- DOI zum Zitieren dieses Dokuments:
- 10.5283/epub.21960
| Dokumentenart: | Hochschulschrift der Universität Regensburg (Dissertation) |
|---|---|
| Open Access Art: | Primärpublikation |
| Datum: | 14 September 2011 |
| Begutachter (Erstgutachter): | Prof. Dr. Herbert Tschochner und Prof. Dr. Michael Thomm und Prof. Dr. Reinhard Sterner |
| Tag der Prüfung: | 26 Juli 2011 |
| Institutionen: | Biologie und Vorklinische Medizin > Institut für Biochemie, Genetik und Mikrobiologie > Lehrstuhl für Biochemie III > Prof. Dr. Herbert Tschochner |
| Themenverbund: | Nicht ausgewählt |
| Stichwörter / Keywords: | RNA Polymerase I, Elongation, Termination, Transkription |
| Dewey-Dezimal-Klassifikation: | 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 570 Biowissenschaften, Biologie |
| Status: | Veröffentlicht |
| Begutachtet: | Ja, diese Version wurde begutachtet |
| An der Universität Regensburg entstanden: | Ja |
| Dokumenten-ID: | 21960 |
Zusammenfassung (Englisch)
RNA polymerase I (Pol I) is a specialized enzyme which transcribes the ribosomal RNA (rRNA) genes in all eukaryotes. Pol I transcription is regulated by specific DNA cis-elements and trans-acting factors as well as the usage of a specific chromatin template. Regulation and efficiency of rRNA synthesis in yeast depend on many processes including recruitment of the Pol I machinery and binding of ...
Zusammenfassung (Englisch)
RNA polymerase I (Pol I) is a specialized enzyme which transcribes the ribosomal RNA (rRNA) genes in all eukaryotes. Pol I transcription is regulated by specific DNA cis-elements and trans-acting factors as well as the usage of a specific chromatin template.
Regulation and efficiency of rRNA synthesis in yeast depend on many processes including recruitment of the Pol I machinery and binding of Pol I-dependent transcription factors to the promoter, activity of the DNA-associated Pol I complexes, termination of transcription at specific sites, and co- and posttranscriptional RNA processing steps.
Analyses of molecular defects of several Pol I mutants as well as the investigation of the immediate downregulation of rRNA synthesis upon growth arrest, mediated by the TOR pathway, were part of this study. Furthermore, an in vivo screen to determine Pol I specific elongation and termination factors has been established and the so far uncharacterized protein Ydr026c has been identified as Pol I termination factor.
The Pol I phosphosites, identified by Jochen Gerber, were further mutated and analysed in vivo. All Pol I phosphorylations were found to be non-essential posttranslational modifications since none of the mutants showed a detectable, significant growth phenotype.
Transcription initiation depends on the A43-Rrn3 complex formation and (de-) phosphorylation of Pol I subunits is likely to be involved in its regulation. We have identified and initially characterized a lethal Pol I mutant which probably interferes with this essential process.
Additionally, the mutation of the A190 phosphosite S685 from serine to aspartate but not to alanine was found to be synthetic lethal with the deletion of the non-essential Pol I subunit A12.2. Our data suggest that the reversible phosphorylation at A190 S685 plays a significant role in Pol I assembly and stability.
Furthermore, a lethal phenotype resulting from a mutation in the TFIIS-like C-terminal domain of the non-essential Pol I subunit A12.2 was initially characterized in vivo.
Regulation of rRNA transcription by reduction of initiation competent Pol I-Rrn3 complexes after TOR inactivation seems to be too slow to explain the strong pre-rRNA processing defects. To distinguish between primary and secondary effects in the regulation of ribosome biogenesis, Pol I transcription and rRNA synthesis were investigated shortly after TOR inhibition by rapamycin. The fast downregulation of mature rRNA synthesis correlates with strong pre-rRNA processing defects and subsequent RNA degradation. The quick downregulation of r-protein synthesis after TOR inhibition is sufficient to explain the severe pre-rRNA processing defects.
To analyse Pol I elongation in vivo we created possible roadblocks for Pol I transcription within every rDNA copy through genetic manipulation of the entire endogenous yeast rDNA locus. We established plasmids for inducible expression of the respective (heterologous) DNA binding proteins and we could demonstrate that many of these proteins bind to their cognate DNA sequence within the transcribed rDNA region. Although they are all blocking transcription in vitro, the binding of some of these proteins hampers, but does not inhibit Pol I elongation in vivo. The presented in vivo system allows the identification of factors supporting Pol I to overcome different barriers.
To identify specific factors involved in Pol I termination, we used an artificially introduced terminator region in every rDNA copy. We could identify and characterize Ydr026c as the Pol I terminator protein. Interestingly, this factor and not the previously published Reb1 is associated with the Reb1 binding site at the termination region in vivo and is required for in vivo Pol I transcription termination. Our data suggests that a `pause and release` mechanism is sufficient to support transcription termination in vivo, which indicates that the recently proposed `torpedo termination` model represents no necessary prerequisite for termination. Additionally, this in vivo system can be used to further characterize Pol I termination.
Übersetzung der Zusammenfassung (Deutsch)
Die RNA Polymerase I (Pol I) ist ein spezialisiertes Enzym, welches die ribosomale RNA (rRNA) in allen Eukaryonten transkribiert. In die Regulation der Polymerase I Transkription sind spezielle DNA cis-Elemente, trans-agierende Faktoren sowie der Gebrauch einer besonderen Chromatinmatrize eingebunden. Die Effizienz und Regulation der rRNA Synthese ist bei der Hefe von vielen unterschiedlichen ...
Übersetzung der Zusammenfassung (Deutsch)
Die RNA Polymerase I (Pol I) ist ein spezialisiertes Enzym, welches die ribosomale RNA (rRNA) in allen Eukaryonten transkribiert. In die Regulation der Polymerase I Transkription sind spezielle DNA cis-Elemente, trans-agierende Faktoren sowie der Gebrauch einer besonderen Chromatinmatrize eingebunden.
Die Effizienz und Regulation der rRNA Synthese ist bei der Hefe von vielen unterschiedlichen Prozessen abhängig. Dazu zählen die Rekrutierung der Pol I Maschinerie und die Bindung Pol I abhängiger Transkriptionsfaktoren an den Promotor, die Aktivität des DNA assoziierten Pol I Komplexes, Transkriptionstermination an genau determinierten Stellen und ko- bzw. posttranslationale RNA Prozessierungsschritte.
Ein Teil dieser Arbeit bestand aus Analysen der molekularen Defekte mehrerer Pol I Mutanten sowie der Erforschung der sofortigen Herabregulation der rRNA Synthese nach Wachstumshemmung, hervorgerufen durch Inaktivierung der TOR Signalweges. Desweiteren wurde ein in vivo Screen etabliert um Pol I spezifische Elongations- und Terminationsfaktoren zu ermitteln. Dabei wurde das bis dahin nicht charakterisierte Protein Ydr026c als Pol I Terminationsfaktor identifiziert.
Die von Jochen Gerber identifizierten Pol I Phosphorylierungsstellen wurden weiter mutiert und in vivo analysiert. Alle Pol I Phosphorylierungen wurden als nicht essenzielle posttranslationale Modifikationen eingestuft, da keine der Mutanten einen signifikantan Wachstumsphänotyp zeigte.
Die Transkriptionsinitiation ist entscheidend von der Bildung des A43-Rrn3 Komplexes abhängig. Die Phosphorylierung bzw. Dephosphorylierung von Pol I Untereinheiten ist wahrscheinlich an der Regulation dieser Komplexbildung beteiligt. Wir haben eine letale Pol I Mutante identifiziert, die diesen essenziellen Prozess möglicherweise beeinträchtigt, und anfänglich charakterisiert.
Bei weiterführenden Untersuchungen wurde die Mutation der Phosphorylierungsstelle S685 der Pol I Untereinheit A190 von Serin nach Aspartat nicht aber nach Alanin in Kombination mit der Deletion der nicht essenziellen Pol I Untereinheit A12.2 für synthetisch letal befunden. Unsere Daten suggerieren eine besondere Rolle der reversiblen Phosphorylierung an dieser Stelle für die Polymeraseassemblierung und –stabilität.
Desweiteren wurde ein letaler Phänotyp, resultierend aus einer Mutation in der TFIIS ähnlichen C-terminalen Domäne der nicht essenziellen Pol I Untereinheit A12.2, anfänglich in vivo charakterisiert.
Bislang ging man davon aus, dass die Regulation der rRNA Transkription durch die Verringerung der initiationskompetenten Pol I-Rrn3 Komplexe nach TOR Inaktivierung geschieht. Dieser Mechanismus ist jedoch zu träge, um die starken prä-rRNA Prozessierungsdefekte zu erklären, die sehr schnell nach TOR Inaktivierung auftreten. Zur Klärung dieser Frage wurden die Pol I Transkription und rRNA Synthese kurz nach TOR Inaktivierung durch Rapamycin untersucht. Hierbei zeigte sich, dass die schnelle Herabregulation der Synthese der reifen rRNA stark mit prä-rRNA Prozessierungsdefekten korreliert und anschließenden RNA Abbau nach sich zieht. Die schnelle Herabregulation der r-Protein Synthese nach TOR Inaktivierung ist dabei ausreichend um die schweren prä-rRNA Prozessierungsdefekte zu erklären.
Zur Untersuchung der Pol I Elongation in vivo wurden über genetische Manipulation des gesamten endogenen rDNA Lokus mögliche Transkriptionsbarrieren für Pol I in jeder rDNA Einheit erzeugt. Desweiteren stellten wir Plasmide zur induzierbaren Expression der jeweiligen (artfremden) DNA Bindeproteine her. Wir konnten zeigen dass viele dieser Proteine an ihre verwandte DNA Bindesequenz innerhalb der transkribierten rDNA binden. Obwohl alle diese Proteine die Transkription in vitro blockieren, wird die Pol I Elongation in vivo durch einige dieser Proteine lediglich erschwert, jedoch nicht komplett verhindert. Das vorgestellte in vivo System erlaubt die Identifikation von Faktoren welche Pol I beim Überwinden verschiedener Barrieren unterstützen.
Zur Identifizierung spezifischer Faktoren, die an der Pol I Termination beteiligt sind, benutzten wir eine künstlich in jede rDNA Einheit eingeführte Terminatorregion. Dadurch konnten wir Ydr206c als Pol I Terminatorprotein identifizieren und charakterisieren. Interessanterweise ist dieser Faktor und nicht das zuvor veröffentlichte Reb1 mit der Reb1 Bindestelle am Terminator in vivo assoziiert und wird für die in vivo Pol I Termination benötigt. Unsere Daten suggerieren, dass ein `pause and release` Terminationsmechanismus ausreichend ist um die Pol I Termination in vivo zu fördern. Dies weist darauf hin, dass das vor kurzem vorgeschlagene `torpedo termination` Modell keine notwendige Voraussetzung für die Pol I Termination darstellt. Zusätzlich kann dieses in vivo System zur weiteren Charakterisierung der Pol I Termination genutzt werden.
Metadaten zuletzt geändert: 26 Nov 2020 06:04
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