| License: Publishing license for publications excluding print on demand (2MB) |
- URN to cite this document:
- urn:nbn:de:bvb:355-epub-228609
- DOI to cite this document:
- 10.5283/epub.22860
| Item type: | Thesis of the University of Regensburg (PhD) |
|---|---|
| Open Access Type: | Primary Publication |
| Date: | 16 August 2012 |
| Referee: | Prof. Dr. Jens Schlossmann and Prof. Dr. Achim Göpferich |
| Date of exam: | 2 December 2011 |
| Institutions: | Chemistry and Pharmacy > Institute of Pharmacy > Pharmacology and Toxicology (Prof. Schlossmann, formerly Prof. Seifert) |
| Interdisciplinary Subject Network: | Not selected |
| Keywords: | cGMP, cGK-I-Komplexe, InsP3R-I-Phosphorylierung, IRAG |
| Dewey Decimal Classification: | 500 Science > 540 Chemistry & allied sciences |
| Status: | Published |
| Refereed: | Yes, this version has been refereed |
| Created at the University of Regensburg: | Yes |
| Item ID: | 22860 |
Abstract (German)
Die cGMP-abhängigen Proteinkinasen (cGKs) haben als Bestandteile des NO/cGMP/cGK-Signalwegs in einer Vielzahl von Organen und Zellen eine große physiologische Bedeutung. Sie werden unter anderem in der glatten Muskulatur von Blutgefäßen oder Gastrointestinaltrakt, in Thrombozyten, in der Niere und im Gehirn exprimiert. Darin spielen cGKs eine wichtige Rolle zum Beispiel bei der Vasorelaxation ...
Abstract (German)
Die cGMP-abhängigen Proteinkinasen (cGKs) haben als Bestandteile des NO/cGMP/cGK-Signalwegs in einer Vielzahl von Organen und Zellen eine große physiologische Bedeutung. Sie werden unter anderem in der glatten Muskulatur von Blutgefäßen oder Gastrointestinaltrakt, in Thrombozyten, in der Niere und im Gehirn exprimiert. Darin spielen cGKs eine wichtige Rolle zum Beispiel bei der Vasorelaxation oder der Hemmung der Thrombozytenaggregation. Es werden zwei Isoformen der cGKI, die in ihrem N-Terminus unterschiedlichen Kinasen cGKIα und cGKIβ, und die cGKII unterschieden. Die mannigfaltigen Effekte der cG-Kinasen werden durch ihre verschiedenen Substratproteine vermittelt. Diese werden durch die Kinasen phosphoryliert und dadurch aktiviert oder gehemmt, oder interagieren mit ihnen in diversen Proteinkomplexen.
Ein Substratprotein der cGKIβ-Isoform ist IRAG, das InsP3Rezeptor-assoziierte cGMP-Kinasesubstrat. Dieses ist in der Membran des endoplasmatischen Retikulums verankert und liegt in einem Makrokomplex mit der cGKIβ und dem Calciumkanal InsP3R-I (Inositoltrisphosphatrezeptor I) vor. Durch cGKIβ-vermittelte IRAG-Phosphorylierung wird die InsP3-induzierte Calciumfreisetzung aus dem endoplasmatischen Retikulum gehemmt. Der Anstieg der intrazellulären Calciumionenkonzentration ist Voraussetzung für eine Vielzahl physiologischer Prozesse, wie Thrombozytenaggregation oder Muskelkontraktion.
Im Rahmen dieser Arbeit wurde die Funktion einer cGKI-abhängigen Phosphorylierung des InsP3R-I untersucht. Bislang war unklar, ob die periphere S2--Form des InsP3R-I, welche auch in Thrombozyten exprimiert wird, direkt durch die cGK phosphoryliert werden kann, und ob dadurch die Calciumfreisetzung beeinflusst wird. Zur Klärung dieser Fragestellung wurde die cGMP-stimulierte Phosphorylierung des InsP3R-I in murinen Wildtyp- und IRAG-KO-Thrombozyten untersucht. Sowohl die Phosphorylierung an Ser1755, der bekannten cGK-Phosphorylierungsstelle, als auch die Gesamtphosphorylierung des Rezeptors waren in Wildtyp- und IRAG-KO-Blutplättchen gleich. Unter den gleichen Bedingungen, unter welchen die InsP3R-I-Phosphorylierung detektiert wurde, wurden Aggregationsexperimente durchgeführt. Durch cGMP konnte die Aggregation der Wildtyp-, aber nicht die der IRAG-KO-Thrombozyten gehemmt werden. Daraus lässt sich schließen, dass die Phosphorylierung des InsP3R-I nicht erforderlich oder nicht ausreichend für eine Hemmung der Aggregation ist.
Die weitere Charakterisierung der Interaktion zwischen IRAG und cGKIβ war ebenfalls Gegenstand der vorliegenden Untersuchungen. Die IRAG-Interaktionsstelle mit der cGKIβ war mittels Hefe-zwei-Hybrid-System bereits im Jahr 2001 identifiziert worden. Im Rahmen dieser Arbeit wurde nun eine IRAG-Mutante hergestellt, bei der jene Interaktionsstelle fehlt (IRAG∆Int). In cGMP-Agarosefällungen zeigte sich, dass durch die Deletion die Interaktion tatsächlich aufgehoben wird. Darüber hinaus wurden das IRAG∆Int-Protein und das WT-IRAG gemeinsam mit der cGKIβ in COS-7-Zellen exprimiert. Es konnte beobachtet werden, dass das WT-IRAG die Kinase im Zytosol verankert. Bei Expression von IRAG∆Int war jedoch nach cGMP-Stimulation der Zellen eine Translokation der Kinase in den Zellkern zu beobachten. Dies kann durch die fehlende Interaktion mit der Kinase erklärt werden.
Zusätzlich zum trimeren Makrokomplex sind in der Literatur weitere cGK-Komplexe beschrieben. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde untersucht, ob diese Interaktionen auch in murinen Thrombozyten oder in der glatten Muskulatur des Colons auftreten. Es wurden WT- und IRAG-KO-Mäuse verwendet, um herauszufinden, ob IRAG ein essentieller Bestandteil der Komplexe ist. Außerdem konnte dadurch der Aufbau der Proteinkomplexe weiter analysiert werden. Es zeigte sich, dass neben dem InsP3R-I auch der InsP3R-III einen Komplex mit IRAG und cGKIβ bildet. Die dritte InsP3R-Isoform, der InsP3R-II, konnte nicht als Interaktionspartner nachgewiesen werden. Sowohl in Thrombozyten, als auch in Colongewebe konnte aber Phospholamban, welches die Aufnahme von Ca2+ ins ER reguliert, als zusätzlicher Bestandteil des Makrokomplexes identifiziert werden. Zudem konnte eine Interaktion zwischen Phospholamban und der cGKIα-Isoform detektiert werden. In der Literatur wurde auch die Phosphodiesterase 5 als Bestandteil des trimeren Makrokomplexes in humanen Thrombozyten beschrieben. Dies konnte in murinen Blutplättchen und Colongewebe nicht bestätigt werden. Ebenso wurde keine Interaktion zwischen der cGKIα-Isoform und MYPT-1, der regulatorischen Untereinheit der Myosinleichtkettenphosphatase, detektiert, obwohl diese Wechselwirkung von mehreren anderen Arbeitsgruppen dargestellt wurde. Diese Interaktion wurde in Experimenten mit murinen Colon- und Uteruslysaten untersucht. Neben dem trimeren Komplex existieren somit noch verschiedene andere cG-Kinasekomplexe, deren Funktion und Interaktionsstellen jedoch häufig noch unklar sind.
Translation of the abstract (English)
The cGMP-dependent kinases (cGKs) are components of the NO/cGMP/cGK-signalling pathway and have a great physiological importance in a multitude of tissues and organs such as smooth muscles and platelets. Two isoforms of the cGKI and the cGKII enzyme are discriminated. cGKIα and cGKIβ differ only in their first ~ 100 amino acids which constitute the leucine zipper and the autoinhibitory domains. ...
Translation of the abstract (English)
The cGMP-dependent kinases (cGKs) are components of the NO/cGMP/cGK-signalling pathway and have a great physiological importance in a multitude of tissues and organs such as smooth muscles and platelets. Two isoforms of the cGKI and the cGKII enzyme are discriminated. cGKIα and cGKIβ differ only in their first ~ 100 amino acids which constitute the leucine zipper and the autoinhibitory domains. The N-terminal leucine zipper domain mediates homodimerization of the kinase and the interaction with diverse substrate proteins. Since cGKIα and cGKIβ express different N-termini they interact with different substrates.
The cGKIβ isoform is assembled in a macrocomplex with the calcium channel Inositoltrisphosphate receptor I (InsP3R-I) and the Inositol-trisphosphate receptor associated cGMP kinase substrate (IRAG) at the endoplasmic reticulum. Stimulation with NO/cGMP results in cGKIβ-mediated phosphorylation of IRAG and subsequent inhibition of the Inositoltrisphosphate (InsP3) induced calcium release from the endoplasmic reticulum. The rise of the intracellular calcium concentration is precondition for a multitude of physiological processes like smooth muscle contraction or platelet aggregation.
We investigated the function of the cGKI stimulated phosphorylation of the InsP3R-I by analysing platelets of WT and IRAG-KO mice. Platelets were incubated with different membrane-permeable cGMP-analogues and the resulting InsP3R-I-phosphorylation was detected. Both the phosphorylation at the preferred cGKI phosphorylation site (Ser1755) and the overall phosphorylation - which was detected by autoradiography - were determined. The densitometry showed in each case an equal increase of the InsP3R-I phosphorylation in WT and IRAG-KO platelets. Aggregation experiments were performed under the same conditions. After preincubation with cGMP the inhibition of aggregation was significantly decreased in IRAG-KO platelets compared to WT platelets. In conclusion, IRAG is essential for the cGMP mediated inhibition of platelet aggregation. In contrast, the cGMP/cGKI dependent phosphorylation of the InsP3R-I is not necessary respectively sufficient for the inhibition of platelet aggregation.
Moreover, the interaction between IRAG and the cGKIβ isoform was further characterized. An IRAG∆Int mutant protein was generated which lacked the known interaction site with the kinase (aa 152-184 of the IRAG protein). This mutant could not be precipitated by cGMP-agarose and – in contrast to IRAG WT protein - allowed nuclear translocation of cGKIβ after co-expression in COS-7 cells.
Additionally to the cGKIβ/IRAG/InsP3R-I signalling complex there are several further cGKI complexes described in the literature. We investigated the interaction between cGKIα or cGKIβ and diverse substrate proteins in murine platelets and smooth muscle tissues. WT and IRAG-KO mice were used to find out whether IRAG is an essential component of the protein complexes.
We performed cGMP-agarose experiments with murine WT and IRAG-KO platelets to examine the IRAG-InsP3R interactions. The InsP3R-II isoform was neither bound to cGMP-agarose nor detected in the anti-IRAG immunoprecipitate. On the other hand, InsP3R-III from WT but not from IRAG-KO platelets was bound to cGMP-Agarose. Hence, InsP3R-III interacts directly with IRAG but not with cGKIβ in murine platelets. However, in colon smooth muscle lysate, InsP3R-III not only interacted with the IRAG protein but was also detected in the anti-cGKIα-immunoprecipitate. Additionally, we analyzed the interaction between the 52 amino acid peptide Phospholamban (PLB), which is also located at the ER and regulates the ER calcium reuptake by the sarco/endoplasmic reticulum Ca2+-ATPase (SERCA), and the two cGKI isoforms. Phospholamban from WT and IRAG-KO platelets was also bound to cGMP-agarose. Subsequent immunoprecipitation experiments with the respective antibodies against the two cGKI isoforms revealed that PLB interacted both with cGKIβ and cGKIα. These results were supported by analysis of colon smooth muscle tissue from WT and IRAG-KO mice. Moreover, the Phosphodiesterase 5 (PDE5) was also described as an element of the IRAG macrocomplex in human platelets. This could not be verified, neither in murine platelets nor in colon smooth muscle tissue. Furthermore, the interaction between the cGKIα isoform and the myosin-binding subunit of myosin phosphatase (MYPT-1) – which was demonstrated by several groups - was also not detectable in murine smooth muscle lysates.
Metadata last modified: 26 Nov 2020 05:45
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