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In this thesis, metabolism profiles of different diseases were measured in body fluids and tissues using high-resolution one-dimensional (1D) and two-dimensional (2D) proton (1H) and carbon-13 (13C) nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy at natural 13C abundance. Protocols for measuring and quantifying low-molecular weight organic molecules in urine, milk, plasma, serum and tissue extracts ...
Zusammenfassung (Englisch)
In this thesis, metabolism profiles of different diseases were measured in body fluids and tissues using high-resolution one-dimensional (1D) and two-dimensional (2D) proton (1H) and carbon-13 (13C) nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy at natural 13C abundance. Protocols for measuring and quantifying low-molecular weight organic molecules in urine, milk, plasma, serum and tissue extracts were established and validated by comparison with established analytical techniques such as gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS), liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) and routine methods from clinical chemistry. It was shown that NMR allowed the quantification of small molecules in complex biofluids. A software named QUANTIFY was developed to enable accurate and reliable quantification from NMR spectra by using spectral integrals and additional information on the respective molecules. For 2D spectra and a recording time of 55 minutes, the lower limits of quantification (LLOQ’s) were between 78 and 350 micromole per liter [µmol/L]. For 1D spectra and a recording time of 15 minutes, LLOQ’s as low as 3 µmol/L were observed, although 1D quantification is not applicable to all metabolites due to signal overlap.
Among others, urine specimens obtained from patients with autosomal dominant polycystic kidney disease (ADPKD), and urine and liver samples from mice with non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD) and non-alcoholic steatohepatitis (NASH) were investigated. Additionally, milk and plasma specimens from dairy cows suffering from production diseases such as ketosis were analyzed. The focus of the latter analyses lay on metabolic traits connected to lipid synthesis and breakdown. The analyses were performed both in a targeted manner, with selected molecules quantified and compared between diseased and healthy individuals, and in fingerprinting approaches, where whole spectra were used to identify unknown biomarkers for different diseases.
Results show that NMR spectra of biofluids or tissue extracts may be used for the diagnosis of disorders such as NASH and ADPKD, and the prognosis of ketosis in dairy cows. Urinary compounds that distinguish NASH from NAFLD were found to be, among others, citric acid, creatinine, leucine, phenylalanine, phosphocreatine, taurine and trimethylamine-N-oxide (TMAO). For ADPKD, the most striking result was a raised urinary methanol level in the ADPKD patient group. In dairy cows, a high ratio of milk glycerophosphocholine (GPC) to phosphocholine (PC) was found to be associated with a low incidence of ketosis. A hypothesis about the biochemical backgrounds of these compounds in disease progression was created and validated by additional NMR measurements of blood plasma.
Übersetzung der Zusammenfassung (Deutsch)
In dieser Doktorarbeit wurden eindimensionale (1D) und zweidimensionale (2D) Protonen- (1H) und Kohlenstoff-13 (13C)-Kernspinresonanz (NMR) verwendet, um Stoffwechselprofile verschiedener Krankheiten in Körperflüssigkeiten und Geweben zu erstellen. Es wurden Protokolle für die Messung und die Quantifizierung von kleinen organischen Molekülen in Urin, Milch, Plasma, Serum und Gewebeextrakten ...
Übersetzung der Zusammenfassung (Deutsch)
In dieser Doktorarbeit wurden eindimensionale (1D) und zweidimensionale (2D) Protonen- (1H) und Kohlenstoff-13 (13C)-Kernspinresonanz (NMR) verwendet, um Stoffwechselprofile verschiedener Krankheiten in Körperflüssigkeiten und Geweben zu erstellen. Es wurden Protokolle für die Messung und die Quantifizierung von kleinen organischen Molekülen in Urin, Milch, Plasma, Serum und Gewebeextrakten entwickelt. Die Resultate wurden durch Vergleiche mit etablierten Analysemethoden wie Gaschromatographie-Massenspektrometrie (GC-MS), Flüssigkeitschromatographie-Tandemmassenspektrometrie (LC-MS/MS) und Routinemethoden der klinischen Chemie validiert. Es wurde gezeigt, dass NMR die Quantifizierung kleiner Moleküle in komplexen Mischungen wie Urin, Plasma, Serum, Milch und Gewebeextrakten ermöglicht. Für diesen Zweck wurde eine Software namens QUANTIFY entwickelt, die mit Hilfe spektraler Intensitäten und zusätzlicher Informationen über das betreffende Molekül eine genaue und zuverlässige Quantifizierung ermöglicht. Für 2D-Spektren mit einer Aufnahmezeit von 55 Minuten wurden untere Quantifizierungsgrenzen (LLOQ’s) zwischen 78 und 350 Mikromol pro Liter [µmol/L] beobachtet. Für 1D-Spektren mit Aufnahmezeiten von 15 Minuten wurden LLOQ’s bis zu 3 µmol/L beobachtet, wobei allerdings wegen Signalüberlagerungen eine Quantifizierung aus 1D-Spektren nicht für alle Metaboliten möglich ist.
Diese neu entwickelten Methoden wurden auf verschiedene Krankheiten angewendet, untersucht wurden unter anderem Urin von Patienten mit autosomal-dominanter polyzystischer Nierenerkrankung (ADPKD) sowie Urin und Leberproben von Mäusen mit nichtalkoholischer Fettlebererkrankung (NAFLD) und nichtalkoholischer Steatohepatitis (NASH). Zusätzlich wurden Milch und Plasma von Milchkühen mit Produktionskrankheiten wie Ketose analysiert. Schwerpunkt dieser Untersuchungen waren Stoffwechselprodukte aus der Synthese und dem Abbau von Lipiden. Durchgeführt wurden sowohl gezielte Untersuchungen, bei denen die Konzentrationen von ausgewählten Stoffen bestimmt wurden, um Unterschiede zwischen gesunden und kranken Individuen zu finden, als auch „Fingerprinting“-Untersuchungen, bei denen komplette Spektren genutzt wurden um bisher unbekannte Biomarker für verschiedene Krankheiten zu identifizieren.
Die Ergebnisse zeigen dass mit NMR-Spektren von Körperflüssigkeiten und Gewebeextrakten die Diagnose von Krankheiten wie NASH und NAFLD sowie die Vorhersage von Ketose in Milchkühen möglich sind. Für NASH und NAFLD wurden im Urin differenzierende Biomarker gefunden, unter anderem Zitronensäure, Creatinin, Leucin, Phenylalanin, Phosphocreatin, Taurin und Trimethylamin-N-Oxid (TMAO). Bei der Untersuchung von ADPKD war ein unerwartetes Resultat ein erhöhter Methanolspiegel im Urin von ADPKD-Patienten. In Milchkühen war ein hohes Verhältnis der Konzentrationen von Glycerophosphocholin (GPC) zu Phosphocholin (PC) mit einem geringen Ketoserisiko verbunden. Es wurde eine Hypothese zu den biochemischen Mechanismen dieser beiden Stoffe bei der Krankheitsentstehung aufgestellt und durch zusätzliche NMR-Messungen von Plasma bestätigt.
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