| License: Publishing license for publications excluding print on demand (3MB) |
- URN to cite this document:
- urn:nbn:de:bvb:355-epub-229639
- DOI to cite this document:
- 10.5283/epub.22963
| Item type: | Thesis of the University of Regensburg (PhD) |
|---|---|
| Open Access Type: | Primary Publication |
| Date: | 15 December 2011 |
| Referee: | Prof. Dr. Armin Buschauer and Prof. Dr. Roland Seifert |
| Date of exam: | 9 December 2011 |
| Institutions: | Chemistry and Pharmacy > Institute of Pharmacy > Pharmaceutical/Medicinal Chemistry II (Prof. Buschauer) |
| Keywords: | histamine H2 receptor, histamine H4 receptor, β2-adrenergic receptor, extracellular domains, neutrophil granulocytes, Sf9 insect cells |
| Dewey Decimal Classification: | 500 Science > 540 Chemistry & allied sciences 600 Technology > 615 Pharmacy |
| Status: | Published |
| Refereed: | Yes, this version has been refereed |
| Created at the University of Regensburg: | Yes |
| Item ID: | 22963 |
Abstract (English)
About one third of the drugs currently available on the market address cell membrane-integrated G protein-coupled receptors (GPCRs). As such, the histamine H2 receptor (H2R) and the β2-adrenergic receptor (β2AR) have been successfully targeted in the treatment of frequently occurring gastric disorders and asthma, respectively. The novel histaminergic GPCR, the histamine H4 receptor (H4R), is ...
Abstract (English)
About one third of the drugs currently available on the market address cell membrane-integrated G protein-coupled receptors (GPCRs). As such, the histamine H2 receptor (H2R) and the β2-adrenergic receptor (β2AR) have been successfully targeted in the treatment of frequently occurring gastric disorders and asthma, respectively. The novel histaminergic GPCR, the histamine H4 receptor (H4R), is currently in the focus of clinical trials as a promising target in the therapy of asthma and allergic rhinitis. However, being involved in many (patho)physiological functions, the H2R, H4R and β2AR gain great interest in academia and industry because of their potential to both, enable novel and to improve established therapeutic interventions.
The first aim of this thesis was the dissection and comparison of the H2R- and β2AR-mediated effects on isolated human neutrophil granulocytes. Activation of both receptors on neutrophils results in an inhibition of inflammatory responses such as superoxide anion (O2•-) production, which could be therapeutically exploited. Although both, the H2R and the β2AR, preferentially couple to Gs proteins, a distinct behavior was observed in respect of their influence on cyclic adenosine 3',5'-monophosphate (cAMP) accumulation and O2•- production in neutrophils and a discrepancy with literature data, obtained in recombinant test systems, was noticed. In addition, ligand-directed signaling was detected, indicative of the concept of functional selectivity and suggesting that signaling events between the cAMP accumulation and the O2•- production are much more complex than assumed so far. Moreover, untypical behavior of H2R antagonists on neutrophils does not fit to the conventional understanding of antagonist/GPCR interaction. Possible reasons for described observations are discussed, although more detailed analyses of the signaling events in neutrophils are needed to mechanistically explain the divergence between the H2R and the β2AR and to better understand the multiplicity of GPCR-mediated signaling.
The second aim of the present work was to characterize NG-acylated hetarylpropylguanidines, highly potent (partial) human H2R-agonists in Sf9 insect cell membranes, in physiologically more relevant human neutrophil granulocytes. In general, new H2R agonists are developed as valuable pharmacological tools and are regarded as novel drug candidates, e.g. in the therapy of acute myeloid leukemia. In contrast to histamine, the O2•- production by activated neutrophils was not affected by bivalent acylguanidines, whereas a monovalent ligand reduced O2•- production in a H2R-independent way. However, the ligands of interest stimulated cAMP accumulation in an H2R-dependent manner, albeit with drastically diminished agonistic activity compared with that in the respective recombinant test system. These results point to a drawback of acylguanidines, e.g. their amphiphilic character, and suggest that their drug-likeness needs to be further improved. Moreover, a contribution to the understanding of molecular interactions between the H2R and NG-acylated hetarylpropylguanidines was made. Mutagenesis studies revealed a rather marginal contribution of the extracelluar N-terminus to the species-selective profile of acylguanidines at the human H2R and the guinea pig H2R.
Preclinical investigation of therapeutically interesting compounds in translational animal models is indispensable in drug research and development. Thus, identification and understanding of substantial pharmacological differences between H4R species orthologs at the molecular level is essential. In the third part of this thesis, the importance of extracellular regions for the species-specific pharmacology of the H4R was evaluated, using chimeric receptor approach and Sf9 insect cells as expression system. This study indicates that the N-terminus and the first extracellular loop are not responsible for the species differences between human and canine H4Rs. On the contrary, for the first time evidence is provided that the second and the third extracellular loop are involved in the H4R activation process. Mutagenesis studies revealed that low amino acid sequence homologies of the latter two loops contribute to the divergence between the inverse agonistic activity of JNJ7777120 (1-[(5-chloro-1H-indol-2-yl)carbonyl]-4-methylpiperazine) at the human and partial agonistic activity at the canine H4R, reported previously. Using a molecular dynamic simulation approach, suggestions about the involvement of the second and third extracellular loops in the inverse/partial agonistic behavior of JNJ7777120 are made at the molecular level.
Translation of the abstract (German)
Ein Drittel der derzeit auf dem Markt befindlichen Arzneimittel bindet an G Protein-gekoppelte Rezeptoren (GPCR). Drei Vertreter dieser GPCR-Familie standen im Mittelpunkt dieser Arbeit: der Histamin H2 Rezeptor (H2R), der β2-adrenerge Rezeptor (β2AR) und der Histamin H4 Rezeptor (H4R). Die H2R Antagonisten werden zur Therapie von peptischen Ulcera eingesetzt, die β2AR Agonisten in der Behandlung ...
Translation of the abstract (German)
Ein Drittel der derzeit auf dem Markt befindlichen Arzneimittel bindet an G Protein-gekoppelte Rezeptoren (GPCR). Drei Vertreter dieser GPCR-Familie standen im Mittelpunkt dieser Arbeit: der Histamin H2 Rezeptor (H2R), der β2-adrenerge Rezeptor (β2AR) und der Histamin H4 Rezeptor (H4R). Die H2R Antagonisten werden zur Therapie von peptischen Ulcera eingesetzt, die β2AR Agonisten in der Behandlung des Asthma bronchiale. Der erste H4R-Antagonist befindet sich gerade in der klinischen Prüfung zur Therapie des Asthma bronchiale und der allergischen Rhinitis. Weil alle drei GPCRs an vielen (patho)physiologischen Prozessen beteiligt sind, sind sie als Zielstrukturen für die Verbesserung bestehender Therapien und für die Etablierung neuer Therapieansätze interessant.
Ein erstes Ziel dieser Arbeit war die Analyse und der Vergleich H2R- und β2AR- induzierter Effekte an isolierten humanen neutrophilen Granulozyten. Aktivierung beider Rezeptoren in diesen Zellen führt zu einer Hemmung entzündlicher Prozesse, z. B. der Superoxid-Anionen (O2•-) Bildung. Obwohl beide Rezeptoren klassisch an Gs Proteine koppeln, beeinflussten die aktivierten H2R und β2AR die Akkumulation von zyklischem Adenosin-3',5'-monophosphat (cAMP) und die O2•- Produktion in Neutrophilen sehr unterschiedlich. Ebenso wurden Unterschiede zu Daten aus rekombinanten Testsystemen gefunden. Ferner ergaben sich Hinweise auf Ligand-spezifische Rezeptorkonformationen, die für das Konzept der funktionellen Selektivität sprechen. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Beziehung zwischen der cAMP-Akkumulation und der Hemmung der O2•- Produktion in Neutrophilen komplexer ist als bisher angenommen. Das in dieser Arbeit beobachtete atypische Verhalten der H2R-Antagonisten ist mit der klassischen Vorstellung der Interaktion zwischen einem GPCR und einem Antagonisten nicht vereinbar. Mögliche Erklärungen für die beobachteten H2R- und β2AR-induzierten Effekte werden diskutiert, wobei zusätzliche Untersuchungen notwendig sind, um die Unterschiede in den untersuchten Signalwegen in Neutrophilen mechanistisch zu verstehen.
Das zweite Ziel der Arbeit war die Charakterisierung monovalenter und bivalenter NG-acylierter Hetarylpropylguanidine, hochpotenter (partieller) Agonisten am humanen H2R in Sf9 Insektenzellen-Membranen, an humanen neutrophilen Granulozyten, da diese Zellen ein physiologisch relevanteres Testsystem darstellen. Diese H2R Agonisten wurden zunächst als pharmakologische Werkzeuge entwickelt, könnten aber auch therapeutischen Nutzen haben, z. B. in der Therapie der akuten myeloischen Leukämie. In Gegensatz zu Histamin hemmten bivalente Acylguanidine die O2•- Produktion in den aktivierten Neutrophilen nicht. Ein monovalenter Ligand zeigte eine hemmende Wirkung auf die O2•- Produktion, die aber H2R-unabhängig verlief. Dennoch stimulierten die untersuchten Liganden die cAMP Produktion über den H2R, aber mit einer stark reduzierten agonistischen Wirkung im Vergleich mit den im rekombinanten Testsystem bestimmten Wirkungen. Die ungünstigen physikalisch-chemischen Eigenschaften der NG-acylierten Hetarylpropylguanidine (z. B. amphiphiler Charakter) müssten wahrscheinlich verbessert werden, um bessere Wirkungen am H2R an Neutrophilen zu erzielen. Zusätzlich trägt diese Arbeit dazu bei, die Interaktionen der Acylguanidine mit dem H2R auf molekularer Ebene besser zu verstehen. So zeigten die Untersuchungen des mutierten H2R, dass der extrazelluläre N-Terminus bezüglich der unterschiedlichen Potenz und intrinsischen Aktivität der Acylguanidine am H2R des Menschen und des Meerschweinchens nur eine marginale Rolle spielt.
Die präklinische Untersuchung neuer Wirkstoffe in translationalen Tiermodellen ist in der Arzneistoffforschung und -entwicklung unverzichtbar. Die Identifizierung und das Verständnis wesentlicher pharmakologischer Unterschiede zwischen H4R Speziesorthologen ist daher essentiell. Im dritten Teil dieser Arbeit wurde die Bedeutung von extrazellulären Domänen für die unterschiedlichen pharmakologischen Eigenschaften des humanen (h) und des caninen (c) H4R untersucht. Dafür wurden h/c-H4R-Chimären generiert und in Sf9 Insektenzellen exprimiert. Unsere Daten deuten darauf hin, dass der N-Terminus und die erste extrazelluläre Schleife keinen Einfluss auf die Speziesunterschiede zwischen hH4R und cH4R haben. Dass die zweite und dritte extrazelluläre Schleife bei der H4R-Aktivierung beteiligt sind, konnte erstmals gezeigt werden. Zum Beispiel ist die sehr niedrige Homologie der Aminosäuren im Bereich der letzten zwei extrazellulären Schleifen zumindest teilweise für die unterschiedlichen Effekt des Liganden JNJ7777120 (1-[(5-Chloro-1H-indol-2-yl)carbonyl]-4-methylpiperazin) am hH4R (inverser Agonist) und cH4R (partieller Agonist) verantwortlich. Die vorgeschlagene Hypothese, dass die zweite und die dritte extrazelluläre Schleife in die inverse agonistische/agonistische Wirkung des JNJ7777120 involviert sind basiert auf molekulardynamischen Simulationen.
Metadata last modified: 26 Nov 2020 05:38
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