| License: Publishing license for publications including print on demand (19MB) |
- URN to cite this document:
- urn:nbn:de:bvb:355-epub-253457
- DOI to cite this document:
- 10.5283/epub.25345
| Item type: | Thesis of the University of Regensburg (PhD) |
|---|---|
| Open Access Type: | Primary Publication |
| Date: | 11 January 2013 |
| Referee: | Prof. Dr. Sigurd Elz and Prof. Dr. Achim Göpferich and PD Dr. Rainer Müller and Prof. Dr. Frank-Michael Matysik |
| Date of exam: | 27 June 2012 |
| Institutions: | Chemistry and Pharmacy > Institute of Pharmacy > Pharmaceutical Technology (Prof. Göpferich) |
| Keywords: | drug targeting, hydrophobic drugs, polyethylene glycol derivatives, polymeric micelles, FRET |
| Dewey Decimal Classification: | 600 Technology > 615 Pharmacy |
| Status: | Published |
| Refereed: | Yes, this version has been refereed |
| Created at the University of Regensburg: | Partially |
| Item ID: | 25345 |
Abstract (English)
This thesis focussed on the encapsulation of hydrophobic drugs into polymeric micelles and was intended to show the strengths and limitations of these self-assembling systems in terms of solubilization and drug targeting. Characterization of hydrophobic drug solubilization prior to intravenous injection was one of the key goals of this thesis. For this purpose a novel drug loading procedure was ...
Abstract (English)
This thesis focussed on the encapsulation of hydrophobic drugs into polymeric micelles and was intended to show the strengths and limitations of these self-assembling systems in terms of solubilization and drug targeting. Characterization of hydrophobic drug solubilization prior to intravenous injection was one of the key goals of this thesis. For this purpose a novel drug loading procedure was developed based on mechanistic considerations during the loading processes (Chapter 2). The cosolvent evaporation combined with appropriate solvent selection prior to preparation was found to be superior to other well investigated methods like direct dialysis and O/W emulsion techniques. This loading procedure was successfully developed for dexamethasone as a model drug but was further applied to all other investigated drugs in this thesis. Furthermore, storage stability of the micellar systems was acquired by lyophilization with excipients, showing that beta-cyclodextrin derivatives are versatile lyoprotectors for these purposes. Besides solubilization, the fate of micelles in biofluids was seen to hamper their application. For this purpose the existing literature was revisited escpecially on the question of micellar in vivo stability and accumulation into tumor tissue (Chapter 1). As a result it was found that colloidal systems undergo several stress factors upon injection that questions
their stability of drug incorporation as well as the colloidal integrity itself. Moreover, tumor accumulation of colloidal systems with native appearance (before injection) of the particle shell was found to be very unlikely. It was argued for an active uptake mechanism into tumor tissue which could be triggered by the protein corona (e.g. albumin via gp-60 receptors in highly SPARC expressing tissues). Based on these results it was reasonable to develop adequate in vitro tests prior to in vivo experiments to assess the micelles’ stability and safety in biological systems. A serum incubation assay was selected to investigate stability which was based on FRET (Foerster Resonance Energy Transfer) (Chapter 3) and was previously described by Chen and Savic. Unfortunately, this assay lacked the possibility of quantifying micellar integrity and therefore to compare different micellar compositions. Consequently this test was further developed for this thesis and direct comparison between different micellar species could be made possible. Micellar safety and potential immunogical responses were assessed with cytotoxicity studies and complement activation assays (Chapter 4). The results showed
impressively that polymers like mPEG-PDLLA were non-toxic in the selected concentrations (up to 10 mg/mL) whereas already approved non-ionic surfactants (Cremophor EL, Tween 80) showed distinct cytotoxicity on both tested cell types (HepG2 cell line, primary rat hepatocytes). The test polymer species PEG-PVPy which was not under previous investigations, showed a slight cytotoxicity in both assays. The complement activation assays revealed the liposomal product Doxil as a stronger in vitro complement activator compared to the investigated block copolymers. Consequently the safety and toxicity of micelles and
their block copolymers did not exceed exisiting products based on colloidal carrier systems. The experimental and theoretical results were very relevant prior to the conduction of in vivo experiments. Animal experiments were intended to show the potential of self-assembling
micelles in drug targeting and altering pharmacokinetics of drugs compared to simple solutions. The first evidence that this concept of altering the pharmacokinetic profile might not fit to the polymeric micelles used in this thesis were delivered from compound A encapsulated
in mPEG-PLGA micelles (Chapter 5). Besides successful preparation and solubilization (solubility increase by factor 180) the in vivo properties of the micellar formulation were identical to the drug solution of compound B (mesylate salt solution of compound A). An enhanced circulation and therfore drug targeting into tumors was not observed. The reasons
for this in vivo observation of the compound A loaded micelles were not that clear so far from this experiment because only the drug was tracked in vivo by using an LC-MS method. No information was acquired about the polymeric carrier. For this reason a follow-up study was designed: drug and carrier should be tracked simultaneously. A H2N-PEG-PLGA derivative was prepared, coupled to DOTA and labeled with 111In. This procedure was quite successful and allowed for simultaneous detection with 125IFF. Compound A and IFF are similarly hydrophobic but indeed show structural differences. Regardless of these differences, IFF is a
model compound to probe the fate of micellar drugs upon injection. The bioimaging revealed remarkable qualitative biodistribution differences between polymeric carrier and encapsulated drug.
Different approaches were followed with the PEG-PVPy material: excellent drug loads with hydrophobic compounds were achieved but only little information was available concerning the in vivo properties of such micelles. To reveal biodistribution and clearance, as a first step
the PEG-PVPy polymer was labeled within the hydrophobic part of the block copolymer because this species was easily accessable for radiolabeling by quarterization of the pyridine N (Chapter 6). As a disadvantage of this experimental setup can be seen that both species,
polymer and drug, were labeled with a radioactive iodine isotope and consequently could not be discriminated. However, this approach showed that PEG-PVPy micelles circulated only within a short time frame (<1 h) but sustained over weeks in RES organs (e.g. liver: half life ~56 h). These results indicated the poor biodegradability of PEG-PVPy. However, the approach for PEG-PLGA was further utilized to reveal the in vivo fate of carrier and drug (Chapter 7): the block copolymer was de novo synthesized and labeled at the PEG part by coupling to DOTA and chelating 111In. In these 111In labeled micelles,131I or 125I labeled IFF drug was incorporated. The different emission energies enabled to distinguish between drug and polymeric carrier. The major outcome of this study was the biodistribution difference of carrier and payload within the same animal. Rapidly upon injection the drug exhibited a different biodistribution pattern compared to its carrier. As previosuly indicated in the chapters 5 and 6 the polymeric associates disassembled quickly.
Translation of the abstract (German)
Diese Dissertation beschäftigt sich mit der Verkapselung hydrophober Wirkstoffe in Polymer-basierenden Mizellen und hatte das Ziel, Stärken und Schwächen dieser selbst-assoziierenden Systeme hinsichtlich Solubilisierung und Drug Targeting aufzuzeigen. Die Charakterisierung der Solubiliserung vor Injektion dieser Partikel war eines der Hauptziele der Dissertation. Dafür wurde ein neues Verfahren ...
Translation of the abstract (German)
Diese Dissertation beschäftigt sich mit der Verkapselung hydrophober Wirkstoffe in Polymer-basierenden Mizellen und hatte das Ziel, Stärken und Schwächen dieser selbst-assoziierenden Systeme hinsichtlich Solubilisierung und Drug Targeting aufzuzeigen. Die Charakterisierung der Solubiliserung vor Injektion dieser Partikel war eines der Hauptziele der Dissertation. Dafür wurde ein neues Verfahren zur Enkapsulierung entwickelt, welches sich auf mechanistische Betrachtungen während des Beladungsprozesses stützt (Kapitel 2). Die Kombination aus Cosolvent Evaporation und Dialyse stellte sich als überlegen gegenüber den Standradverfahren der direkten Dialyse sowie O/W-Emulsionstechnik heraus. Diese optimierte Beladungsmethode wurde erfolgreich für den Modellwirkstoff Dexamethason entwickelt und ebenso für alle anderen Wirkstoffe, die in dieser Arbeit verwendet wurden, angewendet. Darüber hinaus wurde entsprechende Lagerstabilität der Polymer-basierenden Mizellen durch Gefriertrocknung erzielt, wobei sich als geeignete Hilfsstoffe beta-Cyclodextrine als universelle Lyoprotektoren herausstellten.
Neben der Solubilisierung wurde das Verhalten der Mizellen in biologisch relevanten Flüssigkeiten untersucht, welche die Verwendung der Partikel bisher sehr eingeschränkt hatte. Zu diesem Zweck wurde die Literatur hinsichtlich der Frage der in vivo Stabilität und Tumorakkumulation untersucht (Kapitel 1). Als Ergebnis wurden mehrere Stressfaktoren bestimmt, auf die kolloidale Trägersysteme nach Injektion treffen und die sowohl ihre Stabilität als auch die Stabilität der Wirkstoffverkapslung in Frage stellen. Darüber hinaus konnte es als sehr unwahrscheinlich angesehen werden, dass kolloidale Wirkstoffträger mit nativem Zustand der Partikelhülle (vor Injektion) in Tumorgewebe akkumulieren. Es wurde für einen möglichen aktiven Aufnahmemechanismus argumentiert, der durch die Proteinkorona gesteuert wird (z.B. Albumin über den gp-60 Rezeptor in SPARC-überexpremierendem Gewebe).
Basierend auf diesen Ergebnissen wurden entsprechende in vitro Tests vor der Apllikation in in vivo Experimenten entwickelt, die die mizellare Stabilität sowie Sicherheit in biologisch relevanten Medien untersuchen. Die mizellare Stabilität in Serum konnte durch einen FRET (Foerster Resonance Energy Transfer) (Kapitel 3) basierenden Test untersucht werden, der bereits durch Chen und Savic benutzt wurde. Allerdings mangelte es diesem Test an der Möglichkeit der Quantifizierung der mizellaren Stabilität sowie an der Vergleichbarkeit zwischen verschiedenen mizellaren Formulierungen. Daher wurde der Test in dieser Dissertation weiterentwickelt, welches einen direkten Vergleich verschiedenen mizellaren Spezies hinsichtlich ihrer Serumstabilität ermöglichte. Die Sicherheit mizellarer Systeme sowie mögliche immunogene Reaktionen wurden in Zytotoxizitäts- und Komplementsystemaktivierungstests evaluiert (Kapitel 4). Die Ergebnisse zeigten eindeutig, dass Polymere wie z.B. mPEG-PDLLA untoxisch waren in den verwendeten Konzentrationen (bis 10 mg/mL), wohingegen andere bereits zugelassene nicht-ionische Emulgatoren (Cremophor EL, Tween 80) eine gewisse Zytotoxizität auf beiden Testzelllinien ( HepG2 Zelllinie, primäre Rattenhepatozyten) zeigten. Die Polymertestspezies, die bisher nicht in der Literatur untersucht wurde bezüglich Zytotoxizität, war PEG-PVPy, welches zytotoxische Effekte auf beiden Zelllinien zeigte. Zusätzlich zeigte sich in den Komplementaktivierungstests das Marktprodukt Doxil als starker Komplementaktivator im Gegensatz zu den verwendeten Block Copolymer Mizellen. Folglich sollte die Sicherheit und Toxizität der Mizellen die der bereits zugelassenen ähnlich kolloidalen Produkte nicht übersteigen.
Diese experimentellen und theoretischen Ergebnisse waren essentiell, bevor Tierexperimente durchgeführt werden konnten. Diese Tierexperimente sollten die Möglichkeiten der selbst-assoziierenden Systeme hinsichtlich Drug Targeting und Änderung von Wirkstoffpharmakokinetiken im Vergleich zu einfachen Lösungen zeigen. Erste Hinweise, dass das Konzept der Pharmakokinetikänderungen nicht zu tragen schien, kamen aus den Tierexperimenten mit Wirkstoff A beladen mPEG-PLGA Mizellen (Kapitel 5). Neben der erfolgreichen Herstellung und Solubilisierung (Löslichkeitssteigerung um Faktor 180) waren die in vivo Verteilungsergebnisse zwischen mizellaren Lösung und Wirkstofflösung (Mesylatsalz von Wirkstoff A) identisch. Eine verlängerte Zirkulation und eine Akkumulation im Tumor konnte nicht nachgewiesen werden. Die Ursachen für dieses Ergebnis waren nicht offensichtlich, da in diesem Experiment nur die Wirkstoffverteilung untersucht wurde (über LC-MS). Informationen über die Verteilung des polymeren Trägersystems waren nicht verfügbar. Daher wurde in einer Nachfolgestudie Wirkstoff und Träger gemeinsam verfolgt. Es wurde ein H2N-PEG-PLGA Derivat synthetisiert, an DOTA gekoppelt und mit 111-In markiert. Der Ansatz war sehr erfolgreich und erlaubte die gleichzeitige Detektion von 125-IFF. Wirkstoff A und IFF sind ähnlich hydrophob, zeigen aber strukturelle Unterschiede. Trotz dieser Unterschiede ist IFF ein geeigneter Modellwirkstoff, um das Schicksal der Mizellen nach Injektionen zu untersuchen. Das Bioimaging -Experiment zeigte erste, deutliche qualitative Unterschiede in der Bioverteilung zwischen polymerem Träger und eingeschlossenem Wirkstoff.
Verschiedene Ansätze wurden für das PEG-PVPy verfolgt: sehr gute Wirkstoffbeladung mit hydrophoben Wirkstoffen wurden erreicht, aber nur wenige Informationen waren hinsichtlich der Bioverteilung dieser Mizellen verfügbar. Um die Bioverteilung und Ausscheidung zu untersuchen, wurde im ersten Schritt PEG-PVPy im hydrophoben Teil radioaktiv markiert, da dieses Polymer durch eine Quarternisierungsreaktion am Pyridin N (Kapitel 6) leicht zugänglich war. Als Nachteil dieser Markierung lässt sich anführen, dass im Experiment nicht zwischen Polymer- und Wirkstoffmarkierung unterschieden werden kann, da für Beides Iod-Isotope verwendet wurden. Trotzdem zeigte dieser Ansatz, dass PEG-PVPy Mizellen nur sehr kurz im Blut zirkulieren (<1 h), aber sehr lange in den RES Organen verbleibt (z.B. Leberhalbwertszeit ~ 56 h). Diese Ergebnisse bewiesen die schlechte Bioabbaubarkeit von PEG-PVPy.
Dann wurde der Ansatz des PEG-PLGA weitergeführt, um das in vivo Schicksal der Mizellen endgültig aufzuklären (Kapitel 7): ein Copolymer wurde neu synthetisiert, am PEG-Teil markiert, gekoppelt an DOTA, welches schließlich 111-In koppelte. In diese 111-In markierten Mizellen wurde 131-I oder 125-I markiertes IFF eingeschlossen. Die verschiedenen Emissionsenergien der Isotope ermöglichten eine Unterscheidung im Tierexperiment. Das Hauptergebnis der Studie war die unterschiedliche Verteilung von Wirkstoffträger und Wirkstoff im selben Tier. Sehr schnell nach Injektion waren die Bioverteilungsmuster zwischen Wirkstoff und Träger unterschiedlich. Wie bereits in vorigen Studien vermutet (Kapitel 5 und 6), lösen sich die mizellaren Assoziate in vivo sehr schnell auf.
Metadata last modified: 26 Nov 2020 04:27
Owner only: item control page
Download Statistics