| License: Publishing license for publications excluding print on demand (50MB) |
- URN to cite this document:
- urn:nbn:de:bvb:355-epub-255093
- DOI to cite this document:
- 10.5283/epub.25509
| Item type: | Thesis of the University of Regensburg (PhD) |
|---|---|
| Open Access Type: | Primary Publication |
| Date: | 30 July 2012 |
| Referee: | Prof. Dr. Gernot Längst |
| Date of exam: | 23 July 2012 |
| Institutions: | Biology, Preclinical Medicine > Institut für Biochemie, Genetik und Mikrobiologie > Lehrstuhl für Biochemie III > Prof. Dr. Gernot Längst |
| Keywords: | Decondensation factor 31, snoRNA, chromatin higher order structures |
| Dewey Decimal Classification: | 500 Science > 570 Life sciences |
| Status: | Published |
| Refereed: | Yes, this version has been refereed |
| Created at the University of Regensburg: | Yes |
| Item ID: | 25509 |
Abstract (English)
The genetic information of the eukaryotic cell is encoded in the DNA. Chromatin represents the form of packaging of DNA, compacting the DNA to fit into the nucleus. However, chromatin has to allow access to the underlying genetic information as it represents the template for all DNA-dependent processes like replication, repair or transcription (van-Holde, 1989; Woodcock and Ghosh, 2010). Recent ...
Abstract (English)
The genetic information of the eukaryotic cell is encoded in the DNA. Chromatin represents the form of packaging of DNA, compacting the DNA to fit into the nucleus. However, chromatin has to allow access to the underlying genetic information as it represents the template for all DNA-dependent processes like replication, repair or transcription (van-Holde, 1989; Woodcock and Ghosh, 2010). Recent studies indicate RNA to play a major role in chromatin organisation. The existence of RNA co-fractionating with chromatin was shown more than four decades ago (Bonner and Widholm, 1967; Holoubek et al., 1983; Huang and Bonner, 1965; Huang and Huang, 1969). It is supposed that this chromatin-associated RNA (caRNA) serves as a structural component of chromatin. Despite the high abundance of caRNAs, their functional role and how they assist in chromatin folding remained enigmatic.
In this study, the influence of RNA on Drosophila chromatin structure and accessibility was determined. Chromatin accessibility was measured by the sensitivity of chromatin towards the endonuclease Micrococcal nunclease (MNAse). Depletion of cellular RNA resulted in decreased chromatin accessibility in vitro and in vivo, monitored by nuclease sensitivity assays. Decreased chromatin accessibility correlated clearly with RNA depletion and was shown to be due to a change in chromatin conformation. Sucrose gradient sedimentation experiments revealed a proportion of RNA being tightly associated to chromatin. Chromatin containing caRNA adopted an open, decondensed conformation, whereas chromatin that lacked caRNA exhibited a compacted, condensed conformation. Re-addition of caRNA to compact, inaccessible chromatin resulted in subsequent opening of the higher order structures of chromatin. Thus, caRNAs were shown to play a key role in a reversible mechanism organizing higher order structures of chromatin. High-throughput sequencing assays of isolated caRNAs exposed that snoRNA molecules are highly enriched in chromatin compared to the transcriptome in vitro. Furthermore, snoRNAs were demonstrated to be capable of opening up higher order structures of chromatin in sucrose gradient sedimentation experiments.
In a mass spectrometric search for possible mediator proteins, the Decondensation factor 31 (Df31) was identified to be RNA dependently bound to chromatin. Here, Df31 specifically interacted with snoRNA molecules while discriminating random RNAs. The Df31 protein is depicted to tether RNAs to chromatin by simultaneous interactions with H3 tails. Knock-down of the protein resulted in a decrease of chromatin accessibility reminiscent to the depletion of RNA. It is proposed that snoRNA molecules bind to larger genomic domains, targeted by Df31 that distinctively recognizes euchromatic regions to maintain these domains accessible and active.
This molecular mechanism seems to be evolutionary conserved across eukaryotes, as the analysis of caRNAs in human cells also revealed a strong enrichment of snoRNA molecules. Comparable to Drosophila, depletion of cellular RNA in the human system resulted in decreased chromatin accessibility. In search for Df31 homologues in human, the high mobility group protein HMGN5 was identified being the most conserved based on sequence. In this study, HMGN5 was shown to be an RNA-binding protein, localised in both the nucleus and the nucleolus. Furthermore, recent studies describe HMGN5 to maintain euchromatic regions open and accessible (Rochman et al., 2010; Rochman et al., 2009), resembling the localisation and function of Df31.
This study reports a novel role for chromatin-associated snoRNAs in the regulation of higher order structures of chromatin. The working model suggests that snoRNAs in complex with mediator proteins like Df31 cross-link chromatin fibers by protein-mediated interactions with H3 tails. This net-like structure maintains accessible higher order structures of chromatin.
Translation of the abstract (German)
Die genetische Information ist in eukaryotischen Zellen in der DNA kodiert. Chromatin stellt die Verpackungsform der DNA da, welche eine sichere und platzsparende Verwahrung im Zellkern gewährleistet (van-Holde, 1989; Woodcock and Ghosh, 2010). Darüber hinaus erlaubt Chromatin den zellulären Maschinerien jederzeit Zugriff auf die genetische Information. Einige Studien weisen RNA eine ...
Translation of the abstract (German)
Die genetische Information ist in eukaryotischen Zellen in der DNA kodiert. Chromatin stellt die Verpackungsform der DNA da, welche eine sichere und platzsparende Verwahrung im Zellkern gewährleistet (van-Holde, 1989; Woodcock and Ghosh, 2010). Darüber hinaus erlaubt Chromatin den zellulären Maschinerien jederzeit Zugriff auf die genetische Information. Einige Studien weisen RNA eine entscheidende Rolle in der Organisation von Chromatin zu. Es konnte bereits vor etwa vier Dekaden nachgewiesen werden, dass RNA an Chromatin assoziiert ist, wobei angenommen wird, dass die chromatin-assoziierten RNAs (caRNAs) einen strukturellen Bestandteil von Chromatin darstellen (Bonner and Widholm, 1967; Holoubek et al., 1983; Huang and Bonner, 1965; Huang and Huang, 1969). Die Identitäten dieser caRNAs und deren detailierte Rolle in der Faltung von Chromatin verblieben aber bisher im Unklaren.
Diese Studie befasst sich mit dem Einfluß der caRNAs auf die Struktur und Zugänglichkeit von Chromatin in Drosophila melanogaster. Die Zugänglichkeit von Chromatin wurde durch den Einsatz der Endonuklease Micrococcus nuclease (MNase) bestimmt. Die Depletion von zellulären RNA Molekülen führte in vitro und in vivo zur Unzugänglichkeit von Chromatin, wie Zugänglichkeitsanalysen zeigten. Die verringerte Zugänglichkeit von Chromatin zeigte eine starke Korrelation mit dem Verschwinden der RNA Moleküle im System. Der Grund der verringerten Zugänglichkeit von Chromatin nach RNA Depletion wurde in einer Veränderung der Konformation von Chromatin gefunden, die mittels Konformationssanalysen in Saccharose-Gradienten untersucht wurde. Hierbei zeigte Chromatin welches mit RNA assoziiert war, ein offene, zugängliche Konformation, wohingegen RNase A behandeltes Chromatin eher eine kompakte, unzugängliche Konformation einnahm. Die Rückgabe von caRNA Molekülen zu kompaktiertem Chromatin resultierte in einer Rückfaltung zu einer offenen, zugänglichen Konformation von Chromatin. Somit konnte den caRNAs eine grundlegende Rolle in der Öffnung von höheren Organisierungszuständen von Chromatin zugewiesen werden. High-throughput Sequenzierungen von isolierten caRNAs zeigten, dass snoRNA Moleküle am Chromatin im Vergleich zum Transkriptom in vitro hoch angereichert waren. Darüberhinaus demonstrierten Konformationsanalysen, dass diese hoch angereicherten snoRNAs eine aktive Rolle in der Öffnung von Chromatin-Konformationen spielen.
Um mögliche Effektor-Proteine zu ermitteln die in RNA abhängiger Weise am Chromatin assoziieren wurden Massenspektrometische Analysen durchgeführt. Hierbei wurde der Decondensation factor 31 (Df31) identifiziert. Zudem konnte nachgewiesen werden, dass Df31 bevorzugt spezifisch mit snoRNAs in vitro interagiert. Darüber hinaus verstärken die RNA Moleküle die Interaktion von Df31 zu den Histone Proteinen H3 und H4, wie in vitro Analysen demonstrieren. Der knock-down des Proteins führte zu einer verringerten Zugänglichkeit von Chromatin, ähnlich dem Effekt der RNA-Depletion. Es wird angenommen, dass Df31 euchromatische Bereiche des Genoms erkennt und bindet, was dazu führt, dass snoRNAs an diese Bereiche rekrutiert werden und Chromatin offen gehalten werden.
Eine weiterführende Analyse von caRNAs belegte auch dass in humanen Zellen snoRNAs stark angereichert sind und deutet auf eine evolutionäre Konservierung des molekularen Mechanismus hin. Ähnlich dem Drosophila System resultierte die Depletion von RNA Molekülen zur Unzugänglichkeit von Chromatin. Die Suche nach humanen Sequenz-Homologen von Df31 führte zu dem high mobility group protein HMGN5. In vitro konnte dem Protein Df31 homologe Eigenschaften, wie die Fähigkeit der RNA-Bindung sowie die Lokalisation im Nukleus und Nukleolus zugewiesen werden. Zudem zeigen einige Studien, dass HMGN5 euchromatische Regionen offen und zugänglich hält (Rochman et al., 2010; Rochman et al., 2009).
Diese Studie demonstriert, dass chromatin-assoziierte snoRNAs eine grundlegende Rolle in der Regulation von höheren Organisierungsformen von Chromatin zu. Das Arbeitsmodell besagt, dass snoRNAs in Komplex mit Mediator-Proteinen wie Df31 Chromatin-Stränge über H3 Tail Bindingen quervernetzt. Das führt zu einer netzartigen Struktur, welche zugängliche höhere Organisierungsformen von Chromatin ermöglicht.
Metadata last modified: 26 Nov 2020 04:18
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