| License: Publishing license for publications excluding print on demand (32MB) |
- URN to cite this document:
- urn:nbn:de:bvb:355-epub-260207
- DOI to cite this document:
- 10.5283/epub.26020
| Item type: | Thesis of the University of Regensburg (PhD) |
|---|---|
| Open Access Type: | Primary Publication |
| Date: | 17 October 2013 |
| Referee: | Prof. Dr. Reinhard Sterner and Prof. Dr. Frank M. Raushel |
| Date of exam: | 4 October 2012 |
| Institutions: | Biology, Preclinical Medicine > Institut für Biophysik und physikalische Biochemie > Prof. Dr. Reinhard Sterner |
| Keywords: | enzyme design, organophosphate hydrolase |
| Dewey Decimal Classification: | 500 Science > 570 Life sciences |
| Status: | Published |
| Refereed: | Yes, this version has been refereed |
| Created at the University of Regensburg: | Partially |
| Item ID: | 26020 |
Abstract (English)
The analysis of the rapid molecular evolution of enzymes provides insights into the remarkable adaptability of these sophisticated macromolecules and helps to elucidate the relationship between protein sequence, structure and function. A prominent example for rapid molecular evolution in response to changing environmental conditions is the phosphotriesterase from Pseudomonas diminuta (PTE), which ...
Abstract (English)
The analysis of the rapid molecular evolution of enzymes provides insights into
the remarkable adaptability of these sophisticated macromolecules and helps to
elucidate the relationship between protein sequence, structure and function.
A prominent example for rapid molecular evolution in response to changing
environmental conditions is the phosphotriesterase from Pseudomonas diminuta
(PTE), which hydrolyzes with remarkably catalytic efficiency synthetic organophosphates (OPs). Since OPs were invented only in the last century as
agricultural insecticides and highly toxic chemical warfare agents, PTE is a relatively
“young” enzyme. It has been postulated that it has evolved from members of the
phosphotriesterase-like lactonase (PLL) family that show promiscuous organophosphate degrading activity. The goal of this thesis was to mimic this
postulated evolutionary pathway from PLL to PTE in the laboratory by establishing
OP hydrolysis activity on the scaffold of Dr0930, a PLL from the organism
Deinococcus radiodurans R1. Dr0930 and PTE have a similar (βα)8-barrel fold and
share crucial active site features including two catalytically essential bivalent metal
ions.
In the first part of the thesis, steady-state kinetic parameters for D. radiodurans
R1 Dr0930 were determined for the hydrolysis of δ-nonanoic lactone as well as the
promiscuous hydrolysis of the OP insecticides methyl-paraoxon (MPXN) and ethylparaoxon
(EPXN) and the racemic p-nitrophenol (p-NP) analogues of OP nerve
agents VX, sarin (GB), VR, soman (GD), and cyclosarin (GF). The promiscuous
catalytic efficiencies for wild-type Co/Co-Dr0930 range from 2.1 M-1s-1 to
6.1 × 102 M-1s-1 and are four (GD p-NP) to seven (GB p-NP and EPXN) orders of
magnitude lowered when compared to wild-type Co/Co-PTE. Mutually, promiscuous
activity of wild-type PTE for the hydrolysis of δ-nonanoic lactone was found to occur
with a kcat/KM of 6.8 × 101 M-1s-1.
The low promiscuous OP degrading activity of wild-type Dr0930 was increased by
an iterative process comprising several steps of rational protein design and random
mutagenesis in combination with in vitro screening for the hydrolysis of EPXN and six
additional tested OP compounds. Beneficial mutations identified in the different steps
were successively combined, yielding the variant Dr0930_134. Dr0930_134 contains
seven amino acid exchanges (Y28L+D71N+Y97F+E101G+E179D+V235L+P274L)
and its OP hydrolysis activity for GB p-NP, VR p-NP, and GF p-NP is elevated by
four orders of magnitude compared to wild-type Dr0930. The catalytic efficiencies
achieve absolute values of up to 105 M-1s-1. Most remarkably, Dr0930_134 shows a
kcat/KM value of 104 M-1s-1 for the hydrolysis of GD p-NP, which comes close to the
catalytic efficiency of wild-type PTE for this substrate.
The engineered Dr0930 variants were characterized for their residual native
lactonase activities, the stereoselectivity of OP hydrolysis, and the ability to hydrolyze
P-S in addition to P-O bonds. The results showed that the substantial increase in
promiscuous OP hydrolysis activity is accompanied by an equally strong decrease of
the native activity, with Dr0930_134 still achieving a catalytic efficiency of
2.8 × 103 M-1s-1 for the hydrolysis of δ-nonanoic lactone. The increased OP
hydrolysis activity of Dr0930_134 compared to wild-type Dr0930 comes along with an
enhanced stereoselectivity for the less toxic RP enantiomers of the chiral OP
substrates. The shift in the enantiomeric preference [ratio kcat/KM (RP) / kcat/KM (SP)]
was as high as 4.3 × 102 in the case of VR p-NP. The highest enantiomeric
preference of 1.5 × 104-fold was observed for GB p-NP. The engineered Dr0930
variants were tested for their ability to hydrolyze the phosphorothiolate DEVX
(Diethyl-VX), a close analogue of the nerve agent VX. In spite of their high catalytic
efficiency for the hydrolysis of P-O bonds, the kcat/KM values for the hydrolysis of the
P-S bond of DEVX were only 1 M-1s-1.
Structural and computational analysis was performed to identify the structural
basis for the enhanced OP hydrolysis activities of the engineered Dr0930 variants.
Three variants including Dr0930_134 were crystallized, and their X-ray structures
were solved to a resolution of 1.8 - 2.1 Å. The variants exhibited only minor structural
differences relative to wild-type Dr0930. The active site was enlarged and its
hydrophobic character was increased, providing more space to accommodate the OP
substrates. Moreover, additional flexibility was gained due to the elimination of a
hydrogen bond between residues of the βα-loops 2 and 3. In order to identify the
orientation of EPXN at the active site Dr0930_134, the substrate was docked using
the RosettaLigand program. The best poses obtained were similar to the pose of
EPXN when docked into the active site of P. diminuta PTE and confirm site-directed
mutagenesis experiments that have indicated an important role of residues F26 and
R228 for OP hydrolysis activity by Dr0930_134.
Taken together, the results of this thesis show that laboratory evolution can
readily establish high OP hydrolysis on the scaffold of Dr0930, providing strong
evidence for the postulated natural evolution of PTE from members of the PLL family.
Translation of the abstract (German)
Die Analyse der schnellen molekularen Evolution von Enzymen eröffnet Einblicke in die bemerkenswerte Anpassungsfähigkeit dieser komplexen Makromoleküle und trägt somit zum Verständnis der Beziehung zwischen Proteinsequenz, Struktur und Funktion bei. Ein bekanntes Beispiel für schnelle molekulare Evolution in Anpassung an sich schnell verändernde Umweltbedingungen ist die Phosphotriesterase ...
Translation of the abstract (German)
Die Analyse der schnellen molekularen Evolution von Enzymen eröffnet Einblicke
in die bemerkenswerte Anpassungsfähigkeit dieser komplexen Makromoleküle und
trägt somit zum Verständnis der Beziehung zwischen Proteinsequenz, Struktur und
Funktion bei.
Ein bekanntes Beispiel für schnelle molekulare Evolution in Anpassung an sich
schnell verändernde Umweltbedingungen ist die Phosphotriesterase aus
Pseudomonas diminuta (PTE), welche mit einer bemerkenswerten katalytischen
Effizienz synthetische Organophosphate (OP) hydrolysiert. Da diese Verbindungen
erstmals im letzten Jahrhundert als landwirtschaftliche Insektizide und hochgiftige
chemische Kampfstoffe synthetisiert wurden, vermutet man an, dass PTE ein
evolutionär relativ “junges“ Enzym ist. Es wird angenommen, dass sich die PTE aus
der Familie der Phosphotriesterase-ähnlichen Lactonasen (PLL) entwickelt hat,
welche promiskuitive OP hydrolytische Aktivität zeigt. Das Ziel dieser Arbeit war es,
den postulierten Weg der natürlichen Evolution von PLL zu PTE im Labor
nachzuvollziehen. Dazu sollte OP-Hydrolaseaktivität auf dem Proteingerüst von
Dr0930, einer PLL aus dem Organismus Deinococcus radiodurans R1, etabliert
werden. Dr0930 und PTE haben eine ähnliche (βα)8-Barrel Faltung und besitzen
Gemeinsamkeiten im Bereich des aktiven Zentrums einschließlich zweier katalytisch
essentieller zweiwertiger Metallionen.
Im ersten Teil dieser Arbeit wurden die enzymkinetischen Parameter von Dr0930
aus D. radiodurans R1 für die Hydrolyse von δ-Nonalacton bestimmt. Darüber hinaus
wurde die promiskuitive Hydrolyseaktivität von Dr0930 für die OP-Insektizide Methyl-
Paraoxon (MPXN) und Ethyl-Paraoxon (EPXN) sowie für die racemischen p-
Nitrophenol (p-NP) Analoga der OP-Nervenkampfstoffe VX, Sarin (GB), VR, Soman
(GD) und Cyclosarin (GF) gemessen. Die katalytischen Effizienzen für das
wildtypische Co/Co-Dr0930 Protein liegen im Bereich zwischen 2,1 M-1s-1 und
6,1 × 102 M-1s-1. Damit sind sie um vier (GD p-NP) bis sieben (GB p-NP und EPXN)
Größenordnungen niedriger als die katalytischen Effizienzen von wildtypischem
Co/Co-PTE. Umgekehrt zeigt wildtypisches PTE promiskuitive Aktivität für die
Hydrolyse von δ-Nonalacton mit einem kcat/KM von 6.8 × 101 M-1s-1.
Die schwache promiskuitive OP-Hydrolyseaktivität von Dr0930 wurde in einem
iterativen Prozess schrittweise gesteigert, wobei sowohl rationales Design als auch
eine Kombination aus Zufallsmutagenese und in vitro Aktivitätsscreening verwendet
wurden. Dabei wurde die Fähigkeit der erzeugten Mutanten zur Hydrolyse von EPXN
und sechs weiterer OP-Verbindungen getestet. Die in den einzelnen Schritten
identifizierten vorteilhaften Mutationen wurden in der Variante Dr0930_134
kombiniert. Diese enthält 7 Austausche (Y28L+D71N+Y97F+E101G+E179D+V235L
+P274L), die im Vergleich zum wildtypischen Dr0930 zu einer Erhöhung der OP hydrolytischen Aktivität für GB p-NP, VR p-NP und GF p-NP um vier
Größenordnungen führen. Die Absolutwerte für die katalytischen Effizienzen
erreichen Werte von bis zu 105 M-1s-1. Die Hydrolyse von GD p-NP durch
Dr0930_134 erfolgt mit einem kcat/KM Wert von 104 M-1s-1, was im Bereich der
katalytischen Effizienz von wildtypischem PTE für dieses Substrat liegt.
Die evolvierten Dr0930 Varianten wurden anschließend hinsichtlich ihrer nativen
Lactonaseaktivität und bezüglich der Stereoselektivität der OP-Hydrolyse
charakterisiert. Des Weiteren wurde ihre Fähigkeit überprüft, neben P-O Bindungen
auch P-S Bindungen zu hydrolysieren. Die Ergebnisse zeigen, dass die beachtliche
Verbesserung der promiskuitiven OP-Hydrolyseaktivität von einem vergleichbar
starken Verlust der nativen Aktivität begleitet wird. Dennoch erreicht Dr0930_134
immer noch eine katalytische Effizienz von 2.8 × 103 M-1s-1 für die Hydrolyse von δ-
Nonalacton. Die verbesserte OP-Hydrolyseaktivität von Dr0930_134 geht einher mit
einer gesteigerten Stereoselektivität für das weniger giftige RP-Enantiomer der
chiralen OP-Substrate. Die Verschiebung der enantiomeren Präferenz [Verhältnis
kcat/KM (RP) / kcat/KM (SP)] lag für VR p-NP im Bereich von 4.3 × 102. Die höchste
absolute enantiomere Präferenz beträgt 1.5 × 104 und wird für GB p-NP beobachtet.
Die evolvierten Dr0930 Varianten wurden ebenfalls hinsichtlich der Fähigkeit zur
Hydrolyse von Phosphorothiolat DEVX (Diethyl-VX), einem Analogon des
Nervengases VX, getestet. Trotz der effizienten Hydrolyse von P-O Bindungen, lag
der kcat/KM-Wert für die Hydrolyse der P-S Bindung von DEVX bei nur etwa 1 M-1s-1.
Zur Erklärung der hohen OP-Hydrolyseaktivität der evolvierten Dr0930 Varianten
wurden Strukturanalysen und Dockingstudien mit Liganden durchgeführt. Drei
Dr0930 Varianten, einschließlich Dr0930_134, wurden kristallisiert und die
Röntgenstrukturen wurden mit einer Auflösung von 1,8 - 2,1 Å aufgeklärt. Die
Varianten zeigen nur kleine strukturelle Änderungen im Vergleich zum wildtypischen Dr0930 Protein. Das aktive Zentrum der Varianten wurde durch die Austausche
etwas vergrößert und der hydrophobe Charakter gesteigert, wodurch mehr Platz und
eine günstigere Umgebung für die Bindung der OP-Substrate geschaffen wurden.
Darüber hinaus wurde zusätzliche Flexibilität durch die Eliminierung einer
Wasserstoffbrückenbindung zwischen Resten der βα-loops 2 und 3 gewonnen. Um
die Orientierung von EPXN im aktiven Zentrum von Dr0930_134 zu identifizieren,
wurde das Substrat mit Hilfe des RosettaLigand Programms in das aktive Zentrum
modelliert. Die besten Posen waren ähnlich zu den EPXN-Posen, die beim Docking
von EPXN in das aktive Zentrum der PTE erhalten wurden. Zudem erklären die
Ergebnisse die wichtige Rolle der Reste F26 und R228 für die OP-Hydrolyse,
welche auf der Basis von gerichteter Mutagenese postuliert wurde.
Zusammengefasst zeigen die Ergebnisse dieser Arbeit, dass es durch Evolution
im Labor möglich ist, hohe OP-Hydrolyseaktivität auf dem Gerüst von Dr0930 zu
etablieren, was einen starken Hinweis auf die postulierte natürliche Evolution von
PTE aus Mitgliedern der PLL Familie liefert.
Metadata last modified: 26 Nov 2020 03:59
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