| License: Publishing license for publications excluding print on demand (8MB) |
- URN to cite this document:
- urn:nbn:de:bvb:355-epub-265559
- DOI to cite this document:
- 10.5283/epub.26555
| Item type: | Thesis of the University of Regensburg (PhD) | ||||
|---|---|---|---|---|---|
| Date: | 5 November 2012 | ||||
| Referee: | Prof. Dr. Reinhard Sterner | ||||
| Date of exam: | 15 October 2012 | ||||
| Institutions: | Biology, Preclinical Medicine > Institut für Biophysik und physikalische Biochemie > Prof. Dr. Reinhard Sterner | ||||
| Classification: |
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| Keywords: | protein folding, design and evolution, kinetic stabilization, thermostability, Proteinfaltung, Proteindesign, Proteinevolution, Thermostabilität, kinetische Stabilität | ||||
| Dewey Decimal Classification: | 500 Science > 570 Life sciences | ||||
| Status: | Published | ||||
| Refereed: | Yes, this version has been refereed | ||||
| Created at the University of Regensburg: | Yes | ||||
| Item ID: | 26555 |
Abstract (English)
The (βα)8-barrel is amongst the most ancient, frequent and versatile enzyme folds. Sequence and structure comparisons suggest that modern (βα)8-barrels have divergently evolved from a common ancestor, which raises the question whether they share the same folding mechanism. Here, this problem was appraoched by using the thermostable cyclase subunit HisF of imidazole glycerol phosphate (ImGP) ...
Abstract (English)
The (βα)8-barrel is amongst the most ancient, frequent and versatile enzyme folds. Sequence and structure comparisons suggest that modern (βα)8-barrels have divergently evolved from a common ancestor, which raises the question whether they share the same folding mechanism. Here, this problem was appraoched by using the thermostable cyclase subunit HisF of imidazole glycerol phosphate (ImGP) synthase from Thermotoga maritima as a test case.
In the first part of the work, the folding mechanism of HisF was elucidated and compared to the folding mechanisms of other (βα)8-barrel proteins with low sequence identity. The equilibrium unfolding transition of HisF is reversible and adequately decribed by the two-state model without intermediates. Upon refolding at low denaturant concentrations a burst-phase intermediate is formed rapidly. It contains a significant amount of secondary structure but is probably an off-pathway species. In the further course of folding two phases are observed, which are associated with changes in both intrinsic protein fluorescence and far-UV circular dichroism (CD). Double mixing experiments revealed a sequential mechanism with an on-pathway intermediate which is formed in the first phase and converted into the native protein in the second phase. Refolding experiments in presence of the glutaminase subunit HisH of ImGP synthase showed that the formation of native HisF is a prerequisite for complex formation. The refolding of HisF grossly resembles other (βα)8-barrel proteins, suggesting that the general folding properties within this structural class of proteins have been conserved upon the vast sequence and functional diversification during evolution. The increased thermodynamic stability of HisF compared to (βα)8-barrels from mesophiles is entirely due to a drastically decreased unfolding rate.
The pronounced two-fold symmetry of the sequence and the (βα)8-barrel structure of HisF suggest that its fold has arisen by the duplication and fusion of a (βα)4-half-barrel. Primordial (βα)8-barrels mimicking the precursor of HisF were previously constructed by fusing two copies of its C-terminal half-barrel HisF-C. The resulting HisF-CC construct was optimized by rational protein design and directed laboratory evolution, yielding the artificial (βα)8-barrels Sym1 and Sym2.
In the second part of this thesis, the structures, stabilities and folding mechanisms of Sym1 and Sym2 were analyzed and compared with HisF. Sym1 was shown to be less stable than HisF and its crystal structure shows disorder in the contact regions between the two half-barrels. The next-generation construct Sym2 turned out to be more stable than HisF, and the contact regions are well resolved. However, important characteristics of the kinetic folding pathway are identical for the three proteins: At moderate denaturant conditions, unfolding and refolding are mono-exponential reactions, but at native-like conditions, refolding is complex. For all three proteins, HisF, Sym1, and Sym2, an off-pathway burst-phase folding intermediate IBP is observed by far-UV CD, followed by a fast reaction that occurs with comparable rates (τ ~ 3 s) and leads to the on-pathway intermediate I. The subsequent slow and rate-determining folding reaction has a similar rate for HisF and Sym2 (τ ~ 20 s) but a lower rate for Sym1 (τ = 175 s) and leads to the native state N. For Sym2, the additional on-pathway intermediate I’ is formed in an extremely fast reaction (τ = 0.27 s). These findings point to a similar sequential folding pathway for the three proteins (IBP→U→I’→I→N) with I’ being energetically favored in the case of Sym2 but too unstable to be populated in the case of HisF and Sym1. In contrast to the similarities in refolding, the unfolding kinetics of HisF, Sym1, and Sym2 are characterized by extremely different rates which are responsible for their different thermodynamic stabilities. The conservation of the folding mechanism further backs the hypothesis that (βα)8-barrels have evolved from an ancestral (βα)4-half-barrel and provide compelling evidence that Sym1 and Sym2 are realistic models for the early fusion protein product. Moreover, the different stabilities of Sym1 and Sym2 emphasize the significance of optimized contact regions of the fused half-barrels for the generation of a stable (βα)8-barrel with a well-defined folding landscape.
Translation of the abstract (German)
Das (βα)8-barrel gehört zu den ursprünglichsten, vielseitigsten und häufigsten Faltungstypen bekannter Proteine. Sequenz- und Strukturvergleiche legen nahe, dass (βα)8-barrel Enzyme das Produkt einer divergenten Evolution ausgehend von einem gemeinsamen Vorläufer sind. Daraus ergibt sich die Frage, ob alle Vertreter einen gemeinsamen Faltungsmechanismus aufweisen. Die thermostabile ...
Translation of the abstract (German)
Das (βα)8-barrel gehört zu den ursprünglichsten, vielseitigsten und häufigsten Faltungstypen bekannter Proteine. Sequenz- und Strukturvergleiche legen nahe, dass (βα)8-barrel Enzyme das Produkt einer divergenten Evolution ausgehend von einem gemeinsamen Vorläufer sind. Daraus ergibt sich die Frage, ob alle Vertreter einen gemeinsamen Faltungsmechanismus aufweisen.
Die thermostabile Synthase-Untereinheit HisF der Imidazolglycerinphosphat (ImGP)-Synthase aus Thermotoga maritima ist ein sehr gutes Modellprotein, um diese Problemstellung zu untersuchen. Deshalb wurde im ersten Teil dieser Arbeit der Faltungsmechanismus von HisF aufgeklärt und mit anderen potentiell verwandten (βα)8-barrel Proteinen mit niedriger Sequenzidentität verglichen. Die GdmCl-induzierte Entfaltung von HisF ist reversibel und wird durch das apparente Zwei-Zustands-Modell ohne detektierbare Intermediate beschrieben. Bei der Rückfaltung unter nativ-ähnlichen Bedingungen wird schnell ein burst-phase Intermediat gebildet, das einen erheblichen Anteil an definierter Sekundärstruktur aufweist. Im Anschluss zur Bildung dieses vermutlich unproduktiven Intermediats lassen sich zwei Rückfaltungsreaktionen nachweisen, die jeweils zu einer Änderung der intrinsischen Proteinfluoreszenz und des Circulardichroismus- (CD) Signals führen. Anhand von Doppelsprungexperimenten konnte gezeigt werden, dass in der schnellen Phase ein produktives Intermediat gebildet wird, das in einem sequentiellen Mechanismus direkt im Rahmen der langsamen Faltungsphase in den nativen Zustand umgewandelt wird. Ferner belegten Rückfaltungsexperimente in Anwesenheit der Glutaminase-Untereinheit (HisH) der ImGP-Synthase, dass der native Zustand von HisF essentiell für die Komplexbildung ist. Insgesamt zeigt die Rückfaltung von HisF deutliche Übereinstimmungen zu anderen (βα)8-barrel Proteinen. Diese Ergebnisse stützen die These, dass grundlegende Eigenschaften der Faltungsmechanismen von (βα)8-barrel Enzyme trotz der Differenzierung der Aminosäuresequenzen und Funktionen im Laufe der Evolution konserviert wurden. Im Gegensatz zu (βα)8-barrel Proteinen aus mesophilen Organismen weist HisF eine höhere Thermostabilität auf, die auf einer extrem langsamen Entfaltungsrate begründet ist.
Die ausgeprägte zweifache Symmetrie der Aminosäuresequenz und der (βα)8-barrel Struktur von HisF weist auf die Entstehung der Faltung durch Genduplikation und Fusion ausgehend von (βα)4-Einheiten hin. In vorherigen Arbeiten wurde dieser Prozess nachgeahmt, indem ein (βα)8-barrel Protein durch die Fusion zweier identischer Kopien der C-terminalen Hälfte von HisF (HisF-C) konstruiert wurde. Das resultierende Konstrukt HisF-CC wurde durch eine Kombination aus rationalem Proteindesign und gelenkter Laborevolution optimiert, was zu den stabilen artifiziellen (βα)8-barrel Proteinen Sym1 und Sym2 führte.
Im zweiten Teil dieser Arbeit wurden die Struktur, Stabilität und Faltung von Sym1 und Sym2 analysiert und mit dem natürlich evolvierten Enzym HisF verglichen. Sym1 ist weniger stabil als HisF und in der Kristallstruktur sind die Kontaktregionen zwischen den (βα)4-Einheiten nicht aufgelöst. Im Gegensatz dazu ist das stärker optimierte Sym2 stabiler als HisF und auch die Kontaktregionen sind in der Kristallstruktur klar erkennbar. Trotz dieser Stabilitätsunterschiede, weisen die Faltungsmechanismen der drei Proteine deutliche Ähnlichkeiten auf: Bei mittleren Denaturierungsmittelkonzentrationen ist die Ent- und Rückfaltungsreaktion mono-exponentiell, wohingegen die Rückfaltung unter nativ-ähnlichen Bedingungen komplexer ist. Bei allen drei Proteinen, HisF, Sym1 und Sym2, entsteht zunächst ein unproduktives burst-phase Intermediat, gefolgt von einer schnellen Faltungsphase mit ähnlicher Rate (τ ~ 3 s), in der das produktive Intermediat I gebildet wird. In dem folgenden langsamen und raten-limitierenden Schritt wird der native Zustand von HisF und Sym2 mit ähnlicher Rate (τ ~ 20 s) und der von Sym1 mit geringerer Rate (τ = 175 s) gebildet. Zusätzlich zeigt Sym2 ein weiteres produktives Intermediat I‘, das extrem schnell (τ = 0.27 s) gebildet wird. Diese Ergebnisse deuten auf einen übereinstimmenden sequentiellen Faltungsmechanismus für die drei Proteine hin (IBP→U→I’→I→N), wobei I‘ bei Sym2 energetisch begünstigt, aber bei HisF und Sym1 hochenergetisch und dementsprechend nicht detektierbar ist. Im Gegensatz zu diesen Ähnlichkeiten bei der Rückfaltung, unterscheiden sich die Entfaltungsraten von HisF, Sym1 und Sym2 deutlich und sind für die Unterschiede der thermodynamischen Stabilität verantwortlich. Die konservierten Faltungsmechanismen von HisF, Sym1 und Sym2 stützen weiter die These der Entstehung von (βα)8-barrel Proteinen durch die Duplikation und Fusion von (βα)4-barrel Proteinen und zeigen, dass es sich bei Sym1 und Sym2 um realistische Modelle des ursprünglichen Fusionsproteins handelt. Ferner verdeutlichen die Unterschiede der Stabilität von Sym1 und Sym2 die Relevanz der optimierten Kontaktregionen zwischen den fusionierten (βα)4-Einheiten für die Entstehung eines stabilen (βα)8-barrel Proteins.
Metadata last modified: 26 Nov 2020 03:54
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