| License: Publishing license for publications including print on demand (34MB) |
- URN to cite this document:
- urn:nbn:de:bvb:355-epub-273481
- DOI to cite this document:
- 10.5283/epub.27348
| Item type: | Thesis of the University of Regensburg (PhD) |
|---|---|
| Open Access Type: | Primary Publication |
| Date: | 9 January 2014 |
| Referee: | Prof. Dr. Michael Rehli |
| Date of exam: | 1 February 2013 |
| Institutions: | Medicine > Lehrstuhl für Innere Medizin III (Hämatologie und Internistische Onkologie) Biology, Preclinical Medicine > Institut für Biochemie, Genetik und Mikrobiologie > Lehrstuhl für Biochemie III |
| Keywords: | regulatory T cell, conventional T cell, epigenetics, DNA methylation, histone modifications, gene expression, chromatin, transcription factor, Transkriptionsfaktor, regulatorische T Zelle, konventionelle T Zelle, Epigenetik, Chromatin, Genexpression, Histonmodifikationen, DNA Methylierung |
| Dewey Decimal Classification: | 500 Science > 570 Life sciences |
| Status: | Published |
| Refereed: | Yes, this version has been refereed |
| Created at the University of Regensburg: | Yes |
| Item ID: | 27348 |
Abstract (English)
Complex multicellular organisms give rise to a wide range of cell types and tissues, even though all the cells share the same DNA sequence. Key to this diversity is differential gene expression in the different types of cells. Gene expression is orchestrated by regulatory DNA sequences, which can be bound by transcription factors mediating the activation or repression of a target gene. These ...
Abstract (English)
Complex multicellular organisms give rise to a wide range of cell types and tissues, even though all the cells share the same DNA sequence. Key to this diversity is differential gene expression in the different types of cells. Gene expression is orchestrated by regulatory DNA sequences, which can be bound by transcription factors mediating the activation or repression of a target gene. These processes interplay with epigenetic mechanisms including DNA methylation and histone modifications that shape the chromatin structure and control its accessibility for transcription factors and other accessory proteins. Here, regulatory and conventional T cells (Treg and Tconv, respectively) were utilized as a model system to get basic insights in differential gene expression and how it is affected by epigenetic mechanisms. Treg can suppress the activation, proliferation and function of a wide range of immune cells and are thus indispensable for immune homeostasis and tolerance to self-antigens. Tconv develop into different T helper (Th) cells that boost specialized immune reactions. Both Treg as well as Tconv are closely related CD4+ T cells and, due to their variable abilities a suitable model to study differential gene expression.
An adaption of our methyl-CpG-immunoprecipitation method allowed us to systematically investigate DNA methylation in T cells, which resulted in the identification of more than 130 differentially methylated regions (DMRs) between Treg and Tconv. The DMRs were located in the vicinity of immunologically important genes including FOXP3, CTLA4, IL2RA and CD40LG. Most DMRs had a low CpG content, showed no conservation and did not overlap with a gene promoter. In addition, it was demonstrated that many DMRs were associated with “active” histone modifications and showed enhancer activity in reporter assays. These results were among the first to describe widespread differences in DNA methylation at non-promoter regions and to connect them to enhancer function.
CD4+CD25+ Treg represent a heterogeneous population and consist of CD45RA+ naïve Treg as well as CD45RA- memory Treg. Upon in vitro expansion CD45RA- memory Treg downregulate the expression of the Treg lineage-determining transcription factor FOXP3. Hence, we improved technologies to obtain DNA and RNA from intracellular FOXP3-stained and sorted human Treg to analyze stability, plasticity and heterogeneity of Treg subpopulations. Gene expression analyses demonstrated that in vitro expanded CD45RA-FOXP3- Treg differentiated into a proinflammatory Th2-like phenotype and expressed the Th2-associated transcription factor GATA3 as well as the cytokines IL-4, IL-5 and IL-13. Blockade of the Th2-inducing IL-4 signaling pathway did not abrogate the observed Th2 differentiation, arguing for a yet unknown, alternative pathway. In addition, in vitro expanded CD45RA- Treg expressed the Th17-determining transcription factor RORC and IL-17A, with the most significant increase in FOXP3+ cells. In line with these observations, CpGs at the RORC locus were most prominently demethylated in in vitro expanded CD45RA-FOXP3+ cells similar to the methylation status of in vitro generated Th17 cells. In contrast, CD45RA+ naïve Treg showed a stable phenotype without converting into proinflammatory Th2 or Th17-like cells even after prolonged in vitro expansion, and therefore represent the most promising population for clinical applications.
In the context of the FANTOM5 project, modern sequencing methods identified the exact location of transcription start sites (TSS) in primary and in vitro expanded naïve and memory Treg and Tconv. Several thousand non-annotated TSS were discovered, and some were validated as alternative promoters of known genes including the well-studied Treg-specific FOXP3 and CTLA4 genes. In addition, genome-wide histone modification profiling generated the most comprehensive atlas of cell type-specific enhancers in Treg and Tconv subpopulations. De novo motif analysis of enhancer elements identified transcription factors that were potentially involved in cell type-specific gene regulation. Continuative experiments could demonstrate a participation of the transcription factors STAT5 as well as FOXP3 and ETS1 as well as RUNX1 in Treg- or Tconv-specific enhancer architecture, respectively.
Taken together, the molecular characterization of Treg and Tconv subpopulations described in this thesis provided insights into basic principles of gene regulation and demonstrates the impact of DNA methylation, histone modifications and transcription factor binding on cell type-specific gene expression. Moreover, technical refinements of standard methodologies allowed the concrete analysis of the stability, heterogeneity as well as plasticity of T cell subsets. The integrated analysis of genome-wide datasets helped to define key regulators that shape gene expression programs of T cell subpopulations and will be of use to improve the therapeutic potential of Treg for clinical applications.
Translation of the abstract (German)
Obwohl in jeder Zelle dieselbe Erbinformation (DNS-Sequenz) vorliegt, bestehen komplexe Organismen aus einer Vielzahl von Zelltypen und Geweben mit den unterschiedlichsten Eigenschaften. Der Schlüssel zu dieser Vielfalt liegt in der Fähigkeit der verschiedenen Zelltypen, die Erbinformation zelltypspezifisch abzulesen. Das Ablesen oder die sogenannte Expression von Genen wird durch regulatorische ...
Translation of the abstract (German)
Obwohl in jeder Zelle dieselbe Erbinformation (DNS-Sequenz) vorliegt, bestehen komplexe Organismen aus einer Vielzahl von Zelltypen und Geweben mit den unterschiedlichsten Eigenschaften. Der Schlüssel zu dieser Vielfalt liegt in der Fähigkeit der verschiedenen Zelltypen, die Erbinformation zelltypspezifisch abzulesen. Das Ablesen oder die sogenannte Expression von Genen wird durch regulatorische DNS-Sequenzen gesteuert, die unterschiedliche Signale aus intra- und extrazellulären Ereignissen integrieren und interpretieren. Die Vermittler dieser Regulation sind Transkriptionsfaktoren, die an regulatorische DNS-Sequenzen binden können und letztendlich die Aktivierung oder Abschaltung eines Genes verursachen. Diese Prozesse werden von epigenetischen Mechanismen wie DNA Methylierung und Histonmodifikationen beeinflusst, welche die Chromatinstruktur und somit die Zugänglichkeit für Transkriptionsfaktoren zur DNS verändern. Ziel dieser Arbeit war es grundsätzliche Erkenntnisse über differenzielle Genregulation und den Einfluss von epigenetischen Mechanismen zu gewinnen. Als Modellsystem wurden zwei nah verwandte, funktionell aber deutlich unterschiedliche Immunzellen verwendet: regulatorische und konventionelle T Zellen (Treg bzw. Tconv). Treg sind für die Integrität des Immunsystems unersetzlich und werden aufgrund ihrer immunsuppressiven Eigenschaften als Therapeutika in der Klinik eingesetzt. Tconv haben das Potential sich zu unterschiedlichen T-Helferzellen zu entwickeln und spezielle Immunreaktionen zu fördern. Beide Zelltypen gehören zu den CD4+ T Zellen, und sind aufgrund ihrer unterschiedlichen Eigenschaften gut geeignet um differenzielle Genregulation zu untersuchen.
Mit einer Weiterentwicklung unserer Methyl-CpG-Immunpräzipitation konnten wir mehr als 130 differenziell methylierte Regionen (DMR) zwischen Treg und Tconv bestimmen. Die DMR waren in der Nähe von vielen Genen zu finden die maßgeblich an der Funktion von Treg und Tconv beteiligt sind, wie zum Beispiel FOXP3, IL2RA, CTLA4 oder CD40LG. Die DMR hatten einen niedrigen CpG-Gehalt, waren selten konserviert und überlappten nur in wenigen Fällen mit Promotoren. Zusätzlich zeigten einige DMR Enhancer-Aktivität und waren mit „aktiven“ Histonmodifikationen assoziiert. Diese Ergebnisse gehörten zu den ersten, die das Ausmaß von differenzieller DNA Methylierung abseits von Promotoren beschrieben und diese mit Enhancerfunktion in Verbindung bringen konnten.
Da Treg eine heterogene Zellpopulation darstellen und CD45RA- Treg nach in vitro Expansion die Expression des zelltypspezifizierenden Transkriptionsfaktor FOXP3 vermindern, haben wir neue Techniken entwickelt um DNS und RNS aus FOXP3 gefärbten und sortierten Zellen für Analysen zur Genregulation zu gewinnen. Genexpressionsanalysen zeigten, dass vor allem in vitro expandierte CD45RA-FOXP3- Zellen T-Helfer (Th)2 assoziierte Zytokine und Transkriptionsfaktoren wie IL-4, IL-5, IL-13 und GATA3 exprimieren und sich somit in Richtung proinflammatorischer Phänotyp entwickeln. Eine Blockade des IL-4 Signalweges störte die Entwicklung des Th2 Phänotyps nicht, was einen anderen, bislang unbekannten Mechanismus vermuten lässt. CD45RA- expandierte Treg exprimierten zusätzlich den Th17-assozieerten Transkriptionsfaktor RORC und das Zytokin IL-17A. Dieses Phänomen war vor allem in der CD45RA-FOXP3+ Zellfraktion zu beobachten. DNA Methylierungsmuster am RORC Genlokus spiegelten dessen Expression wieder: CD45-FOXP3+ Treg wiesen hier die stärkste Hypomethylierung auf, die der von in vitro generierten Th17 Zellen sehr ähnlich war. In beiden Untersuchungen stellten sich in vitro expandierte CD45RA+ naive Treg als die stabile Treg Zellpopulation heraus und sollten demnach für klinische Zwecke verwendet werden.
Im Rahmen des FANTOM5 Projektes konnten wir mit modernen Methoden alle Transkriptionsstartpunkte und deren Expression in naiven und antigenerfahrenen primären und in vitro expandierten Treg und Tconv bestimmen. Neben detaillierter Genexpressionsanalysen war es uns zudem möglich, neue alternative Promotoren an selbst intensiv untersuchten Genen wie FOXP3 und CTLA4 bestimmen. Zusätzlich haben wir durch genomweite Histonmodifikationsanalysen tausende von zelltypspezifischen Enhancerelementen bestimmt. De novo Motifanalysen dieser regulatorischen DNS Sequenzen führten zur Identifikation von Transkriptionsfaktoren, die potentiell an der zelltypspezifischen Genregulation beteiligt sind. In weiterführenden Experimenten konnten wir die Beteiligung von STAT5 und FOXP3 an Treg spezifischer- sowie ETS1 und RUNX1 an Tconv-spezifischer Enhancerarchitektur bestätigen.
Zusammenfassend konnten wir grundlegende Einblicke in die differenzielle Genregulation unter dem Einfluss epigenetischer Mechanismen gewinnen. Zusätzlich können die Erkenntnisse über Genregulation, Stabilität, Heterogenität und Plastizität von T Zellsubpopulationen den Einsatz von Treg in der Klinik verbessern.
Metadata last modified: 26 Nov 2020 03:20
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