| License: Publishing license for publications excluding print on demand (319MB) |
- URN to cite this document:
- urn:nbn:de:bvb:355-epub-279296
- DOI to cite this document:
- 10.5283/epub.27929
| Item type: | Thesis of the University of Regensburg (PhD) |
|---|---|
| Open Access Type: | Primary Publication |
| Date: | 13 March 2014 |
| Referee: | Prof. Dr. Gernot Längst |
| Date of exam: | 11 March 2013 |
| Institutions: | Biology, Preclinical Medicine > Institut für Biochemie, Genetik und Mikrobiologie > Lehrstuhl für Biochemie III > Prof. Dr. Gernot Längst |
| Keywords: | chromatin architecture, nucleosome positioning, TNFa, MNase-Seq, gene regulation, TTF-I, chromatin looping, rDNA |
| Dewey Decimal Classification: | 500 Science > 570 Life sciences |
| Status: | Published |
| Refereed: | Yes, this version has been refereed |
| Created at the University of Regensburg: | Yes |
| Item ID: | 27929 |
Abstract (English)
Every cell in the human body contains the identical hereditary information, encoded in the DNA. The sequence of the human genome was deciphered one decade ago as part of the Human Genome Project (International Human Genome Sequencing Consortium, 2001, 2004; Venter et al., 2001). Remarkably, knowledge of the sequence could not explain the spatial and temporal differences in gene expression, which ...
Abstract (English)
Every cell in the human body contains the identical hereditary information, encoded in the DNA. The sequence of the human genome was deciphered one decade ago as part of the Human Genome Project (International Human Genome Sequencing Consortium, 2001, 2004; Venter et al., 2001). Remarkably, knowledge of the sequence could not explain the spatial and temporal differences in gene expression, which result in the various tissues composing a human body. It becomes more and more evident that several epigenetic pathways are required to regulate transcription in a time- and context-dependent manner. This thesis investigates one particular mechanism in detail, the functional effect of chromatin architecture on gene regulation. In eukaryotes, DNA is compacted into chromatin, with nucleosomes being the basic packaging unit. In general, chromatin can be classified into two major states, the transcriptionally active euchromatin and the repressed heterochromatin (Woodcock and Ghosh, 2010). Gene expression is closely linked to the structural and spatial arrangement of the chromatin domains in the nucleus, with silent genomic loci tethered to the nuclear periphery and active regions located in the center (Takizawa et al., 2008). To allow access of DNA-binding proteins involved in transcription, replication or repair, the nucleoprotein complex is capable of dynamically changing its accessibility upon physiological cues. Chromatin dynamics are modulated by a number of different factors, e.g. ATP-dependent chromatin remodeling machines, histone chaperones and histone-modifying enzymes (Margueron and Reinberg, 2010).
This study aimed to elucidate the structure-function relation of chromatin in mammalian cells on both a global and a local scale. First, chromatin dynamics were analyzed on a genome-wide level. Several high-throughput assays were developed, including formalde-hyde-assisted isolation of regulatory elements (FAIRE)-Seq to monitor the tissue-specific usage of regulatory elements in human blood cells. In addition, micrococcal nuclease (MNase)-Seq was applied to study global re-positioning of nucleosomes and to identify functionally different chromatin domains according to their accessibility. High-throughput sequencing of mono- and dinucleosomal DNA from HeLa cells reveals a condensed chromatin structure at promoters of repressed genes and a defined, open structure around the transcription start sites (TSSs) of highly expressed genes. Further characterization of the determined chromatin domains uncovers correlation of very accessible, open structures with increased occupancy of RNA polymerase (RNAP) II, CTCF and activating histone marks. In contrast, less accessible chromatin is associated with low gene density and expression. Remarkably, the two states differ in nucleosome spacing, directly reflecting accessibility and the respective higher-order organization. Furthermore, MNase-Seq of primary human cells treated with the proinflammatory cytokine TNFα reveals genome-wide re-positioning of nucleosomes. Strikingly, chromatin structures around responsive TSSs but also throughout the gene body open up gradually, as monitored at 10 and 30 min after stimulation. In addition, defined nucleosome positioning and a distinct histone PTM signature are observed at exon/intron junctions, in particular around novel recursive splicing sites. The global opening precedes transcription and is most pronounced at ‘hotspots’ carrying binding sites for NF-κB and associated proteins. Exposure of the binding sites is probably achieved by TNFα-specific chromatin remodeling and occurs predominantly at promoter regions, exons and Alu repeats. Finally, this thesis links altered chromatin structures in Down syndrome patients to upregulated expression of histone clusters and chromatin-associated proteins.
In a second chapter, this thesis focuses on the local chromatin architecture of ribosomal RNA (rRNA) genes in mouse. Previous studies showed that actively transcribed or poised rRNA genes form promoter-terminator chromatin loops (Németh et al., 2008). Here, a hamster cell line harboring one repeat of mouse rDNA is introduced as a new model system to elucidate functional dynamics in chromatin looping on a single gene scale. Both promoter and terminator comprise binding sites for the Transcription Termination Factor for RNA polymerase I (TTF-I), therefore, the impact of this protein on chromatin looping is investigated in detail. Notably, TTF-I binds cooperatively to the target site cluster at the rRNA gene terminator in a chromatin-dependent manner. Furthermore, the cluster enhances gene expression directly by increasing the loading of RNAPI and transcription factors to the gene. In addition, the results indicate that TTF-I binding is indispensible for establishing the chromatin loop by mediating promoter-terminator interactions. According to the ribomotor model, the loop structure promotes efficient recycling of polymerases and associated proteins, explaining the observed effects in factor occupancy and gene expression. In summary, the chromatinized TTF-I binding site cluster at the rRNA gene terminator acts as an enhancer element by physically interacting with the promoter, up-regulating transcription levels by transcription factor recruitment and exhibiting a defined chromatin signature linked to active regulatory elements.
Translation of the abstract (German)
Jede Zelle des menschlichen Körpers enthält die identische Erbinformation, codiert in der DNA. Die Sequenz des Humangenoms wurde vor zehn Jahren im Laufe des Humangenom Projekts entschlüsselt. Interessanterweise konnte das Wissen über die Sequenzabfolge der Nucleobasen allein keine Auskunft über die differentielle Genexpression geben, welche letztlich zum Entstehen der unterschiedlichen Gewebe- ...
Translation of the abstract (German)
Jede Zelle des menschlichen Körpers enthält die identische Erbinformation, codiert in der DNA. Die Sequenz des Humangenoms wurde vor zehn Jahren im Laufe des Humangenom Projekts entschlüsselt. Interessanterweise konnte das Wissen über die Sequenzabfolge der Nucleobasen allein keine Auskunft über die differentielle Genexpression geben, welche letztlich zum Entstehen der unterschiedlichen Gewebe- und Zelltypen im Körper führt. Stattdessen scheinen epigenetische Mechanismen eine wichtige Rolle in der Regulation der Transkription zu spielen. Diese Dissertation beschäftigt sich im Detail mit einem dieser Mechanismen, dem funktionellen Effekt der Chromatinarchitektur auf die Genregulation. Die eukaryotische DNA liegt kompaktiert als Chromatin vor, wobei das Nukleosom als Grundstruktur dient. Im Allgemeinen werden zwei Zustände von Chromatin unterschieden: das transkriptionell aktive Euchromatin sowie das inaktive Heterochromatin (Woodcock und Gosh, 2010). Dabei steht die Genexpression in direktem Zusammenhang mit der strukturellen und räumlichen Anordnung der Chromatindomänen im Nukleus. Inaktive genomische Regionen sind in der Regel an der Peripherie des Nukleus zu finden wohingegen aktive loci in der Mitte angeordnet sind (Takizawa et al., 2008). Der Nukleoprotein Komplex Chromatin kann seine Zugänglichkeit dynamisch regulieren um DNA-Bindeproteinen, die an Transkription, Replikation oder DNA Reparatur beteiligt sind, Zugang zu erlauben. Diese Dynamik wird durch verschiedene Faktoren ermöglicht, darunter z.B. ATP-abhängige Chromatin remodeling Maschinen, Histon Chaperone sowie Histon-modifizierende Enzyme (Margueron und Reinberg, 2010).
Im Rahmen dieser Studie wurde das Verhältnis von Chromatinstruktur und –funktion in Säugerzellen sowohl auf globaler als auch auf lokaler Ebene untersucht. Im ersten Teil wurde die Chromatindynamik genomweit analysiert. Hierfür wurden verschiedene Hochdurchsatz-Sequenzierungs Methoden etabliert, unter anderem die Formaldehyd-gestützte Isolierung regulatorischer Elemente (engl.: formaldehyde-assisted isolation of regulatory elements = FAIRE) um gewebsspezifische Unterschiede in der Nutzung regulatorischer Elemente in humanen Blutzellen zu untersuchen. Des Weiteren wurde Micrococcus Nuklease (MNase)-Seq eingesetzt um die globale Repositionierung von Nukelosomen zu evaluieren sowie um funktionell unterschiedliche Chromatindomänen anhand ihrer Zugänglichkeit zu identifizieren. Hochdurchsatz-Sequenzierung von mono- und dinukleosomaler DNA aus HeLa Zellen zeigte, dass die Chromatinstruktur an den Promotoren nicht exprimierter Gene stark kompaktiert vorliegt, wohingegen der Transkriptionsstart transkribierter Gene sich in einer offenen Struktur befindet. Die weitere Charakterisierung der Chromatindomänen konnte eine Korrelation von sehr zugänglichen Chromatinstrukturen und dem erhöhtem Auftreten von RNA Polymerase (RNAP) II, CTCF sowie aktivierenden Histonmodifikationen aufdecken. Im Gegensatz dazu ist das weniger zugängliche Chromatin mit einer geringeren Gendichte und –expression assoziiert. Nicht zu übersehen war auch der Unterschied der beiden Chromatinfraktionen in Bezug auf das charakteristische „spacing“ von Nukleosomen, welches direkt die Faltung in Chromatinüberstrukturen reflektiert. In einem weiteren Experiment wurden humane Primärzellen zuerst mit dem pro-inflammatorischen Zytokin TNFα behandelt und anschließend mit Hilfe von MNase-Seq untersucht. Dabei wurde die genomweite Depletion sowie Repositionierung von Nukleosomen aufgedeckt. Die Chromatinstruktur öffnete sich schrittweise nicht nur im Bereich um induzierbare Traskriptionsstarts sondern über das gesamten Gen hinweg. Die globale Chromatinöffnung findet vor der Elongation statt, ist an „Hotspots“ lokalisiert, welche Bindemotife für NF-κB und assoziierte Proteine beinhalten, und möglicherweise an TNFα-spezifisches Chromatin remodeling gekoppelt. Des Weiteren konnte sowohl eine definierte Positionierung von Nukleosomen als auch eine spezifische Kombination von Histonmodifkationen an Exon/Intron Grenzen detektiert werden, wobei sich neu identifizierte rekursive Spleißstellen von klassichen Donor- und Akzeptorstrukturen unterscheiden.
Der zweite Teil dieser Dissertation beschäftigt sich mit der lokalen Chromatinstruktur der ribosomalen RNA (rRNA) Gene in der Maus. In vorrausgehenden Studien wurde gezeigt dass aktiv transkribierte rRNA Gene eine Chromatinschleife („Loop“) zwischen Promotor und Terminator ausbilden (Némteh et al., 2008). In dieser Arbeit wurde ein neues Modellsystem erarbeitet indem ein einzelnes murines rDNA Minigen in eine Hamster Zelllinie integriert wurde. Auf diese Weise sollte die funktionelle Dynamik des Chromatin looping auf der Ebene eines einzelnen Gens untersucht werden. Sowohl die Promoter- als auch die Temrinatorregion der rDNA beinhalten Bindestellen für den Transkriptions Terminations Faktor für RNA Polymerase I (engl.: Transcription Termination Factor for RNA Polymerase I = TTF-I). Daher wurde der Einfluss des Proteins auf das Chromatin looping im Detail analysiert. Dabei wurde gezeigt dass TTF-I kooperativ an den Cluster von Bindestellen in der rRNA Gen Terminatorregion bindet. Dieser Cluster erhöht die Genaktivität direkt durch verstärkte Rekrutierung von RNAP I und Transkriptionsfaktoren an das Gen. Außerdem deuten die Ergebnisse der Studie daraufhin dass TTF-I unabdingbar für die Ausbildung der Promotor-Terminator Interaktionen ist. Die erhöhte Transkription sowie Faktorbindung ist in Übereinstimmung mit dem Ribomotor Modell, demzufolge die Ausbildung der Chromatinschleife effizientes Recycling der Polymerase unterstützt. Zusammenfassend scheint der TTF-I Cluster in der Terminatorregion der rRNA Gene als Enhancer zu wirken, indem er mit dem Promotor wechselwirkt, die Genaktivität durch Rekrutierung von Transkriptionsfaktoren erhöht und über eine definierte Kombination von aktivierenden Histonmodifikationen verfügt.
Metadata last modified: 26 Nov 2020 02:58
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