| License: Publishing license for publications excluding print on demand (10MB) |
- URN to cite this document:
- urn:nbn:de:bvb:355-epub-279496
- DOI to cite this document:
- 10.5283/epub.27949
| Item type: | Thesis of the University of Regensburg (PhD) |
|---|---|
| Date: | 10 March 2014 |
| Referee: | Prof. Dr. Armin Buschauer |
| Date of exam: | 8 March 2013 |
| Institutions: | Chemistry and Pharmacy > Institute of Pharmacy > Pharmaceutical/Medicinal Chemistry II (Prof. Buschauer) |
| Keywords: | hyaluronan, hyaluronidases, electrophoresis, chromatography |
| Dewey Decimal Classification: | 500 Science > 540 Chemistry & allied sciences 600 Technology > 615 Pharmacy |
| Status: | Published |
| Refereed: | Yes, this version has been refereed |
| Created at the University of Regensburg: | Yes |
| Item ID: | 27949 |
Abstract (English)
Hyaluronan (HA) and HA oligosaccharides, which are produced when HA is enzymatically degraded by hyaluronidases, are supposed to have various size-dependent biological effects. To study the (patho)physiological role of HA oligosaccharides, appropriate (bio)analytical methods are a prerequisite. Hence, hyphenated chromatographic and electrophoretic techniques were developed and optimized. ...
Abstract (English)
Hyaluronan (HA) and HA oligosaccharides, which are produced when HA is enzymatically degraded by hyaluronidases, are supposed to have various size-dependent biological effects. To study the (patho)physiological role of HA oligosaccharides, appropriate (bio)analytical methods are a prerequisite. Hence, hyphenated chromatographic and electrophoretic techniques were developed and optimized.
Capillary zone electrophoresis coupled to time-of-flight mass spectrometry (CZE–ESI-TOF-MS) is suited for oligosaccharides comprising up to 20 disaccharide moieties. The method was optimized with regard to fast separations, allowing for assessment of hyaluronidase activity quasi in real-time. MS enables the unambiguous identification of substrates and products. Requiring only very small sample volumes, CZE–ESI-TOF-MS with short capillaries is the method of choice when samples are only available in tiny amounts. High performance anion exchange chromatography with pulsed amperometric detection (HPAEC–PAD) was optimized for the sensitive determination of oligosaccharides comprising 2–25 disaccharide units. Hence, HPAEC complements gel electrophoresis for studying HA degradation, covering a broad range of differently sized products. High sensitivity with an LOD of 0.2–0.3 pmol recommends the method for determination of low concentrations. High performance thin layer chromatography (HPTLC) is most convenient for rapid quality control of purified oligosaccharides. Using amino-modified silica, reagent-free derivatization enabled rapid densitometric quantification. Coupling of TLC on normal phase with MS was successfully applied to the qualitative analysis of these samples.
The newly developed analytical methods were applied to the study of hyaluronidases of different origins. HPAEC–PAD was ideal for monitoring the time-dependent degradation of a low molecular weight HA oligosaccharide mixture. Fast CZE–ESI-TOF-MS was preferably used for at-line analysis of the degradation of purified oligosaccharides. Product spectra of bovine testicular hyaluronidase (BTH) and hyaluronidase from Streptococcus agalactiae were compared. BTH exhibited a complex degradation profile of hydrolysis and transglycosylation reactions, leading to a mixture of different oligosaccharides. In the presence of the bacterial enzyme, the unsaturated disaccharide accumulated, other oligosaccharides were intermediately liberated during the reaction. Thereby, the unsaturated tetrasaccharide was the prevailing intermediate. The saturated tetrasaccharide (minimal substrate) was used for determination of kinetic parameters according to the Michaelis-Menten theory at pH = 5.0, using 5 IU/mL of the enzyme. Samples were analyzed by HPAEC–PAD. Km = 923 ± 106 µM and vmax = 3.68 ± 0.20 nmol/min were determined.
Recombinant human Hyal-1, PH-20, and PEGylated PH-20 were characterized regarding pH profiles and degradation of HA oligosaccharides. These enzymes had optima at acidic pH values of 3.5 and 4.0, respectively. No assay-dependent differences were observed. Degradation of HA oligosaccharides was similar to BTH. Nevertheless, differences with regard to the product spectra, depending on pH, were identified. Evaluation of the inhibitory effects of vitamin C palmitate, indomethacin, and diclofenac (50–1000 µM) on rhHyal-1 and rhPH-20 revealed only very weak inhibition. As increasing concentrations of the enzyme led to dramatic loss in maximum inhibition, evaluable curves were only obtained at low enzyme activity.
Moreover, HPAEC–PAD and CZE–ESI-TOF-MS were proven to be suitable for the determination of HA and HA oligosaccharides from a biological matrix (synovial fluid). Although the samples differed regarding content and size distribution of HA, hyaluronidase activity, and viscoelastic properties, there was no obvious correlation between the measured parameters.
HA, an HA oligosaccharide mixture, and purified oligosaccharides were used for biological investigations. By electrical cell–substrate impedance sensing (ECIS), an inhibitory effect of the hexasaccharide (1 mg/mL, ≈ 865 µM) on recovery of electrode coverage with endothelial cells after an electrical wounding pulse was observed. Similar effects were found in cell proliferation experiments using ECIS and the crystal violet assay. However, it may be doubted that such high concentrations of the hexasaccharide occur under physiological conditions. Native HA and a more complex mixture of oligosaccharides had no effects. High concentrations of the oligosaccharide mixture led to an acidification of the culture media. In view of their putative role in HA oligosaccharide signaling, the expression of the HA receptors RHAMM and CD44 by different cell lines was analyzed using flow cytometry. Finally, a CAM assay was performed to study putative effects of HA oligosaccharides on angiogenesis. Oligosaccharides had no effect, whereas there was a weak tendency to antiangiogenesis in the presence of high molecular weight HA.
Translation of the abstract (German)
Hyaluronsäure (HA) und HA-Oligosaccharide aus dem enzymatischen Abbau der HA durch Hyaluronidasen besitzen möglicherweise diverse größenabhängige biologische Wirkungen. Um die (patho)physiologische Bedeutung der HA-Oligosaccharide zu untersuchen, sind (bio)analytische Methoden eine Grundvoraussetzung. Daher wurden „gekoppelte“ chromatographische und elektrophoretische Verfahren entwickelt und ...
Translation of the abstract (German)
Hyaluronsäure (HA) und HA-Oligosaccharide aus dem enzymatischen Abbau der HA durch Hyaluronidasen besitzen möglicherweise diverse größenabhängige biologische Wirkungen. Um die (patho)physiologische Bedeutung der HA-Oligosaccharide zu untersuchen, sind (bio)analytische Methoden eine Grundvoraussetzung. Daher wurden „gekoppelte“ chromatographische und elektrophoretische Verfahren entwickelt und optimiert.
Kopplung von Kapillarzonenelektrophorese mit Flugzeit-Massenspektrometrie (CZE–ESI-TOF-MS) eignet sich für Oligosaccharide bis 20 Disaccharideinheiten Sie erlaubt schnelle Trennungen zur Bestimmung von Hyaluronidaseaktivitäten quasi in Echtzeit. MS ermöglicht die eindeutige Identifizierung von Substraten und Produkten. CZE–ESI-TOF-MS mit kurzen Kapillaren die Methode der Wahl, wenn nur geringe Probenvolumina verfügbar sind. Hochleistungs¬anionen¬austausch¬chromatographie mit gepulster amperometrischer Detektion (HPAEC–PAD) wurde für die empfindliche Bestimmung von Oligosacchariden mit 2 – 25 Disaccharideinheiten optimiert. So decken HPAEC und klassische Gelelektrophorese gemeinsam einen weiten Größenbereich bei der Untersuchung der Produkte des HA-Abbaus ab. Die hohe Empfindlichkeit (LOD: 0,2 – 0,3 pmol) prädestiniert die Methode für die Bestimmung niedriger Konzentrationen. Hochleistungs¬dünnschicht¬chromatographie (HPTLC) eignet sich bestens für die schnelle Qualitätskontrolle gereinigter Oligosaccharide. Amino-modifiziertes Kieselgel ermöglichte eine Derivatisierung ohne Reagenzien und eine schnelle densito¬metrische Quantifizierung. Kopplung von TLC auf Normalphase mit MS wurde erfolgreich für die qualitative Analytik verwendet.
Die neu entwickelten Analyseverfahren wurden zur Charakterisierung verschiedener Hyaluronidasen verwendet. HPAEC–PAD war ideal, um den zeitabhängigen Abbau einer niedermolekularen HA-Oligosaccharidmischung zu verfolgen. Schnelle CZE–ESI-TOF-MS wurde bevorzugt in der „at-line“ Analytik des Abbaus gereinigter Oligosaccharide angewandt. Produktspektren der bovinen testikulären Hyaluronidase (BTH) und der Hyaluronidase aus Streptococcus agalactiae wurden verglichen. Bei BTH traten Hydrolyse und Transglykosylierung auf, wobei Mischungen verschiedener Oligosaccharide entstanden. Im Falle des bakteriellen Enzyms waren die Endprodukte ungesättigte Disaccharide. Weitere Oligosaccharide entstanden intermediär. Dabei war die Bildung des ungesättigten Tetrasaccharids offenbar bevorzugt. Das gesättigte Disaccharid (Minimalsubstrat) wurde für die Bestimmung kinetischer Parameter nach der Michaelis-Menten-Theorie verwendet. Das Substrat wurde mit 5 IE/mL des Enzyms bei pH = 5,0 umgesetzt und mit HPAEC–PAD bestimmt. Km = 923 ± 106 µM und vmax = 3,68 ± 0,20 nmol/min wurden ermittelt.
Rekombinantes humanes Hyal-1, PH-20 und PEGyliertes PH-20 wurden bezüglich der pH-Profile und des Abbaus von HA-Oligosacchariden charakterisiert. Die pH-Optima lagen im Sauren bei pH-Werten von 3,5 bzw. 4,0. Dabei wurden keine methodenabhängigen Unterschiede beobachtet. Der Abbau der Oligosaccharide glich den Ergebnissen mit BTH. Jedoch unterschieden sich die Produktspektren in Abhängigkeit vom pH-Wert. Vitamin C-Palmitat, Indomethacin und Diclofenac (50 – 1000 µM) bewirkten nur eine sehr schwache Hemmung der Enzymaktivität von rhHyal-1 und rhPH-20. Mit zunehmender Enzymkonzentration sank die maximale Hemmung stark, weshalb auswertbare Kurven nur für niedrige Enzymaktivitäten erhalten wurden.
Ferner wurde die Eignung von HPAEC–PAD und CZE–ESI-TOF-MS für die Bestimmung von HA und HA-Oligosacchariden aus biologischer Matrix (Synovialflüssigkeit) nachgewiesen. Trotz Unterschieden in Gehalt und Größenverteilung der HA, Hyaluronidaseaktivität und viskoelastischer Eigenschaften zeigte sich kein Zusammenhang der verschiedenen Messparameter.
Schließlich wurden HA, eine Oligosaccharidmischung und gereinigte Oligosaccharide für biologische Untersuchungen verwendet. In einem impedanzbasierten Testsystem (ECIS) verlangsamte das Hexasaccharid (1 mg/mL, ≈ 865 µM) die erneute Bedeckung einer Elektrodenoberfläche durch Endothelzellen nach einem elektrischen Verwundungspuls. Ähnliche Ergebnisse zeigten sich in Proliferationsexperimenten mittels ECIS und Kristallviolett-Assay. Das physiologische Auftreten derart hoher Konzentrationen an Hexasaccharid erscheint jedoch eher unwahrscheinlich. Native HA und eine komplexere Oligosaccharidmischung zeigten keine Wirkung. Das Oligosaccharidgemisch führte in hohen Konzentrationen zu einer Ansäuerung des Kulturmediums. Wegen ihrer möglichen Rolle bei der Auslösung von zellulären Signalen durch HA-Oligosaccharide wurde die Expression der HA-Rezeptoren RHAMM und CD44 bei verschiedenen Zelllinien mittels Durchflusszytometrie untersucht. Zur Untersuchung möglicher Wirkungen der HA-Oligosaccharide auf die Angiogenese wurde abschließend ein CAM-Assay durchgeführt. Während Oligosaccharide keinen Effekt zeigten, war in Gegenwart hochmolekularer HA eine schwache Tendenz zur Hemmung der Angiogenese erkennbar.
Metadata last modified: 26 Nov 2020 02:57
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