| License: Publishing license for publications excluding print on demand (8MB) |
- URN to cite this document:
- urn:nbn:de:bvb:355-epub-282218
- DOI to cite this document:
- 10.5283/epub.28221
| Item type: | Thesis of the University of Regensburg (PhD) |
|---|---|
| Open Access Type: | Primary Publication |
| Date: | 12 June 2013 |
| Referee: | PD Dr. Attila Németh and Prof. Dr. Thomas Cremer and Prof. Dr. Gunter Meister |
| Date of exam: | 4 June 2013 |
| Institutions: | Biology, Preclinical Medicine > Institut für Biochemie, Genetik und Mikrobiologie > Lehrstuhl für Biochemie III |
| Keywords: | Epigenomik, DNA Methylierung |
| Dewey Decimal Classification: | 500 Science > 570 Life sciences |
| Status: | Published |
| Refereed: | Yes, this version has been refereed |
| Created at the University of Regensburg: | Yes |
| Item ID: | 28221 |
Abstract (English)
With the sequencing of the human genome essentially complete, a comprehensive view is now needed on how the genetic information is established in different cell types and developmental stages and how it is inherited through cell divisions. Nowadays,the focus lies on chemical modifications to DNA and histone proteins that form a complex regulatory network to modulate genome function which is ...
Abstract (English)
With the sequencing of the human genome essentially complete, a comprehensive view is now needed on how the genetic information is established in different cell types and developmental stages and how it is inherited through cell divisions. Nowadays,the focus lies on chemical modifications to DNA and histone proteins that form a complex regulatory network to modulate genome function which is called the epigenome of a cell.
DNA modifications, particularly the methylation of DNA in the context of CpG, is such an important epigenetic mark that regulates gene expression and therefore, adds extra information to the genome of mammalian cells. DNA methylation has an important role in development, differentiation and genome stability and aberrant DNA methylation profiles are found in many diseases such as cancer [36], autoimmune diseases, neurodevelopmental disorders and neurodegenerative diseases.
Thus, deciphering the information that is encoded in DNA modifications is necessary for fully understanding not only the mechanisms of epigenetic regulation but also their dysfunctions that cause different diseases. Therefore, various methods have been established for the analysis of DNA modifications (mainly DNA methylation). However, it is very difficult or impossible to examine the epigenetic linkage of two distant chromosomal loci, i.e. the associated inheritance of epigenetic modifications at different genomic loci through cell divisions with established experimental approaches. Additionally, crucial information about the genomic localization is lost when repetitive DNA is analyzed. Therefore, novel single molecule methods become increasingly important. In this thesis, different single molecule methods are established, that either enable the locus-specific analysis of nucleosomal patterns or DNA modifications.
The psoralen-combing assay applies the Dynamic molecular combing method on psoralen crosslinked DNA. The technique allows sequence-specific, genome-wide single molecule analysis of chromatin structures based on their psoralen accessibility, at the megabase scale with kilobase resolution. Proof-of-principle experiments are performed demonstrating that the method can be potentially applied for single molecule characterization of chromatin structures, particularly at tandem repeat arrays.
Epi-combing is described as a novel sequence-specific single molecule method to analyse DNA modifications by combining Dynamic molecular combing with DNA modification immunodetection. It can be applied for the investigation of DNA methylation patterns at large, highly repetitive regions of genomic DNA, as well as for epigenetic linkage analysis of kilobase-sized, modified DNA bearing chromosomal regions. Proof-of-principles were performed on native and in vitro modified �DNA and these experiments demonstrate that the detection of DNA modifications on single DNA fibers is specific, sensitive as well as selective.
In addition, epi-combing was successfully applied to the analysis of tandem repeat arrays of human genomic DNA, namely satellite-2 DNA and ribosomal DNA. Both sequence classes build the core of the nucleolar genome [95] and are highly repetitive, which makes their DNA methylation status difficult to analyse with conventional technologies. By examining satellite-2 DNA with epi-combing in HCT116 cells, heavily methylated stretches were revealed, which display an average length of 76 kb, however, satellite-2 DNA stretches of 200 kb length were found, too. The analysis of ribosomal DNA by epi-combing further revealed novel insights into the organization of DNA methylation patterns on these repetitive transcription units. The standard concept is that ribosomal RNA genes are composed of arrays of identical repeats that are clustered in a mainly head-to-tail orientation on specific
chromosomal loci, the "nucleolar organizer regions" (NORs).
It is assumed that an entire NOR is either completely active containing unmethylated rDNA or completely inactive bearing methylated DNA, which is also propagated throughout the cell cycle.
Data presented in this work confirm the epigenetic clustering of many repeats, however transitions of DNA methylation status between individual repeats could also be found which challenges the standard view on NOR activity. In addition, the epigenetic state of non-canonical rDNA repeats could be revealed in this work. By epi-combing, the silencing of those aberrant repeats via DNA methylation could be proven, and reduced DNA methylation levels of non-canonical repeats were shown in malignant and senescent cells.
Ribosomal RNA genes are regulated by different epigenetic mechanisms including chromatin remodelling besides DNA methylation. Another major regulator of ribosomal DNA is Tip5, the large subunit of the Nucleolar remodelling complex (NoRC). NoRC is a multifunctional chromatin-dependent regulator of rRNA genes, which regulates nucleosome positioning, transcriptional repression, epigenetic silencing and replication timing. However, little is known about its role in large-scale spatial organization and distribution of actively transcribed and inactive rRNA gene copies. Nuclear matrix isolations enable a simple biochemical characterization of large-scale chromatin organization and therefore, this method was applied to reveal the function of Tip5 in large-scale chromatin organization of the rDNA locus.
Since the TAM domain and AT-hooks of Tip5 are predicted MAR binders [2], Tip5 may mediate the anchoring of rDNA to the nuclear matrix and thus, separate silenced rDNA repeats from active ones. In the presented work, experiments were performed that prove the Tip5-dependent reorganisation of rDNA in the nuclear matrix by overexpressing of the protein. Furthermore, the DNA binding ability of Tip5 was shown in microscale thermophoresis experiments that demonstrate the potential of AT-hook binding to rDNA and MARs. Additional findings show that the combination of AT-hooks together with the TAM domain of Tip5 are sufficient for nuclear matrix targeting and anchoring, however, the entire Tip5 protein is necessary for rDNA specificity.
In summary, by establishing and applying new methods such as epi-combing and microscale thermophoresis, this work provides novel insights into the epigenetic regulation of mammalian rRNA genes, a process that must be tightly balanced due to the highly energy-demanding metabolic activity of the cell.
Translation of the abstract (German)
Nachdem das menschliche Genom mittlerweile vollständig sequenziert wurde, ist nun das Verständnis notwendig, wie die genetische Information in unterschiedlichen Zelltypen und unterschiedlichen Entwicklungsstadien etabliert und während Zellteilungen vererbt wird. Heutzutage liegt der Fokus der Forschung auf vererbbaren chemischen Modifikationen der DNA und der Histonproteine, welche ein komplexes ...
Translation of the abstract (German)
Nachdem das menschliche Genom mittlerweile vollständig sequenziert wurde, ist nun das Verständnis notwendig, wie die genetische Information in unterschiedlichen Zelltypen und unterschiedlichen Entwicklungsstadien etabliert und während Zellteilungen vererbt wird.
Heutzutage liegt der Fokus der Forschung auf vererbbaren chemischen Modifikationen der DNA und der Histonproteine, welche ein komplexes regulatorisches Netzwerk bilden um die Genomfunktion zu modulieren, was als Epigenom bezeichnet wird. DNA Modifikationen, genauer die Methylierung der DNA im Kontext CpG, ist solch eine wichtige epigenetische Markierung, welche die Genexpression wie Lichtschalter reguliert und zusätzliche Information zu dem genetischen Erbgut von menschlichen Zellen kodiert.
DNA Methylierung spielt eine wichtige Rolle in der Entwicklung, Differenzierung und der Genomstabilität und Studien zeigten, dass abweichende DNA Methylierungsmuster in vielen Krankheiten wie Krebsarten, Autoimmunkrankheiten und Neurodegenerativen Störungen vorkommen. Die Entschlüsselung der Information, welche in DNA Modifikationen kodiert ist, ist somit nicht nur essentiell um die Mechanismen der epigenetischen Regulation, sondern auch um den Grund vieler Krankheiten zu verstehen.
Daher gibt es bereits einige Methoden, um DNA Modifikationen, vor allem DNA Methylierung, zu untersuchen. Alle diese Methoden können allerdings die wichtige Frage nach der epigenetischen Koppelung nicht beantworten.
Zur Zeit ist es sehr schwierig wenn nicht sogar unmöglich zu untersuchen, ob zwei in linearer Sequenz weit voneinander entfernte DNA Loci epigenetisch verflochten sind (epigenetische Koppelung). Das heißt wenn der Lichtschalter bei einem Gen aus ist (DNA Methylierung), wie ist der Lichtschalter bei einem benachbarten Gen gestellt? Dies ist zum Beispiel von besonderem Interesse wenn repetitive DNA untersucht wird, das heißt es kann nicht beantwortet werden, ob die DNA Methylierung bei nebeneinander liegender repetitiver DNA in Cluster auftritt oder nicht. Ebenso geht mit den zur Zeit vorhandenen Methoden viel Information über die DNA Modifikationen von repetitiver DNA verloren, weil diese Methoden den Durschnitt der DNA Modifikation aller DNA Moleküle und aller repetitiven Sequenzen auf einmal misst.
Da das humane Genom zu mehr als der Hälfte aus repetitiven Sequenzen besteht, bedeutet dies, dass die epigenetischen Mechanismen bei mehr als 50 Prozent der DNA noch unbekannt sind und auch mit den aktuellen Methoden nicht erforscht werden können.
Daher wurde in dieser Arbeit unter anderem eine einzigartige Einzelmolekülanalyse mit Namen „Epi-combing“ entwickelt, welche die lokus-spezifische und sequenzspezifische Untersuchung von epigenetischen Mustern ermöglicht.
Epi-combing wird beschrieben als eine neuartige sequenzspezifische Einzelmolekülmethode, welche die Technik Dynamic Molecular Combing vereint mit einer Immunfluoreszenzdetektion der DNA Modifikation.
Der große Vorteil in dieser Methode besteht darin, dass sie die Analyse von DNA Methylierungsmustern ermöglicht an großen, stark repetitiven Regionen genauso wie die Untersuchung der epigenetischen Kopplung von chromosomalen Bereichen über mehrere Kilobasen hinweg.
Experimente auf künstlich modifizierter lambda Phagen DNA zeigten, dass die Methode selektiv, sensitiv und auch spezifisch ist und somit für die Analyse auf genomischer DNA geeignet ist. Ebenso konnte gezeigt werden, dass „Epi-combing“ eine der wenigen Methoden ist, welche verschiedene DNA Modifikationen unterscheiden kann wie zum Beispiel 5-methylcytosin von 5-hydroxymethylcytosin.
Neben der Entwicklung und Etablierung dieser Methode, konnten im Rahmen der Promotion zusätzlich noch biologisch relevante Fragestellungen mit „Epi-combing“ beantwortet werden.
„Epi-combing“ wurde daher erfolgreich angewendet, um unter anderem die DNA Methylierungsmuster von ribosomalen RNA Genen und Satelliten-DNA auszuwerten. Da beide Sequenzklassen hochrepetitiv sind, sind sie nur schwer mit anderen Methoden als Epi-combing zu untersuchen.
Die Analyse von ribosomaler DNA mit „Epi-combing“ brachte neue Einsichten in die Organisation der DNA Methylierungsmuster an diesen aufeinander folgenden Transkriptionseinheiten. So war das Standardkonzept, dass ribosomale RNA Gene (rDNA) aus benachbarten identischen Einheiten bestehen, welche sich geballt auf spezifischen Loci befinden, den „Nucleolar Organizer Regions“ (NORs). Weiter wurde angenommen, dass diese NORs entweder komplett aktiv mit nicht methylierter ribosomaler DNA oder komplett inaktiv mit methylierter rDNA sind und sich dieser Zustand über den Zellzyklus hinweg nicht ändert.
Meine Arbeit zeigt erstmalig Daten die beweisen, dass es zwar die Anhäufung von DNA Methylierung an benachbarten rDNA Einheiten gibt, aber auch Übergänge von methylierten zu unmethylierten Einheiten auf demselben NOR stattfinden können. Ein Ergebnis, welches mit keiner anderen als mit der eigenständig entwickelten Methode „Epi-combing“ und seiner Auflösung von bis zu einer Kilobase möglich ist und die Ansicht der klassischen Aktivität von NORs herausfordert.
Zusätzlich konnte gezeigt werden, dass die sogenannten nicht-kanonischen Einheiten von rDNA durch DNA Methylierung inaktiviert sind. Diese Frage beschäftigt die Wissenschaft seit nun mehr fast einem Jahrzehnt als gezeigt wurde, dass diese abnormalen ribosomalen RNA Gene vorkommen. Bisher gab es allerdings keine Möglichkeit diese zu untersuchen, da sie sich von klassischen ribosomalen RNA Genen oft nur in der Orientierung unterscheiden und somit mit Standardmethoden nicht zugänglich sind.
Besonders interessant ist das Ergebnis, dass diese abnormalen ribosomalen RNA Gene in malignen oder senescenten Zellen weniger methyliert sind. Gepaart mit der Bedeutung von korrekter rDNA Transkription für die Zelle, könnte das fehlende Stummschalten der nicht-kanonischen Einheiten eine Erklärung für das Voranschreiten eines malignen oder senescenten Zustandes sein.
Während der Promotion konnte somit eine neue sequenz- und allelspezifische Detektionsmethode entwickelt werden, welche in Zukunft neue Einsichten in ein breites Anwendungsgebiet wie zum Beispiel Epigenetik von Centromeren, X-Chromosom Inaktivierung oder in die klinische Diagnostik liefern kann. Erfolgreich eingesetzt wurde „Epi-combing“ bereits bei ribosomaler DNA, wodurch gezeigt wurde, dass etablierte Standardkonzepte zur NOR Aktivität zum Teil nicht korrekt sind oder abnormale rDNA in Fibroblasten zum Schutz der Zelle inaktiviert ist, dieser Schutzmechanismus allerdings in malignen und senescenten Zellen reduziert ist.
Metadata last modified: 26 Nov 2020 02:47
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