| License: Publishing license for publications excluding print on demand (4MB) |
- URN to cite this document:
- urn:nbn:de:bvb:355-epub-285768
- DOI to cite this document:
- 10.5283/epub.28576
| Item type: | Thesis of the University of Regensburg (PhD) |
|---|---|
| Open Access Type: | Primary Publication |
| Date: | 25 July 2013 |
| Referee: | Prof. Dr. Reinhard Sterner |
| Date of exam: | 19 July 2013 |
| Institutions: | Biology, Preclinical Medicine > Institut für Biophysik und physikalische Biochemie > Prof. Dr. Reinhard Sterner |
| Keywords: | (βα)8-Barrel, Enzymevolution, Proteindesign, Phosphoribosylanthranilat-Isomerase, Imidazolglycerinphosphat-Synthase, Hybridkatalysator enzyme evolution, protein design, phosphoribosylanthranilate isomerase, imidazole glycerol phosphate synthase, hybrid catalyst |
| Dewey Decimal Classification: | 500 Science > 540 Chemistry & allied sciences 500 Science > 570 Life sciences |
| Status: | Published |
| Refereed: | Yes, this version has been refereed |
| Created at the University of Regensburg: | Yes |
| Item ID: | 28576 |
Abstract (German)
Die Grundlage dieser Arbeit bildete das artifizielle (βα)8-Barrel-Protein Sym2. Sym2 ist ein thermostabiles Protein und entstand im Rahmen einer experimentellen Rekonstruktion der (βα)8-Barrel-Evolution im Labor. Dieser lag die Hypothese zugrunde, dass heutige (βα)8-Barrel Enzyme aus einem gemeinsamen Vorfahren halber Länge – dem (βα)4-Halbbarrel – durch Duplikation, Fusion und Diversifikation ...
Abstract (German)
Die Grundlage dieser Arbeit bildete das artifizielle (βα)8-Barrel-Protein Sym2. Sym2 ist ein thermostabiles Protein und entstand im Rahmen einer experimentellen Rekonstruktion der (βα)8-Barrel-Evolution im Labor. Dieser lag die Hypothese zugrunde, dass heutige (βα)8-Barrel Enzyme aus einem gemeinsamen Vorfahren halber Länge – dem (βα)4-Halbbarrel – durch Duplikation, Fusion und Diversifikation entstanden sind. Um diesen postulierten Evolutionsweg im Labor nachzustellen, wurde das C-terminale (βα)4-Halbbarrel der Imidazolglycerinphosphat-Synthase aus dem hyperthermophilen Bakterium T. maritima (HisF) HisF-C dupliziert und in tandem fusionert. Das resultierende HisF-CC-Konstrukt wurde anschließend durch Proteindesign über HisF-C*C und HisF-C**C zu HisF-C***C (=Sym1) sukzessive stabilisiert. Obwohl die Röntgenstruktur des artifiziellen und katalytisch inaktiven (βα)8-Barrel-Proteins Sym1 aufgeklärt werden konnte, waren Bereiche an der Kontaktstelle der beiden Hälften und am C-terminalen Ende nicht sichtbar. Aus diesem Grund wurde Sym1 durch einen Austausch der terminalen (βα)-Module gegen die entsprechenden (βα)-Module 4 aus HisF weiter stabilisiert und so das thermostabile Protein Sym2 erhalten.
Um die Grundlagen der erhöhten Stabilität von Sym2 aufzuklären und die strukturelle Basis zur enzymatischen Aktivierung von Sym2 zu legen, wurde das Protein im ersten Teil der Arbeit kristallisiert und seine Struktur gelöst. Die Analyse der Struktur zeigte, dass ein symmetrisches Salzbrückencluster, sowie hydrophobe Wechselwirkungen durch pi-stacking die Erhöhung der Stabilität bewirken. Zudem zeigte sich, dass die Etablierung von HisF-Aktivität aufgrund der Abstände der Phosphatbindestellen und katalytisch wichtiger Aspartat-Reste sehr schwierig erscheint. Die hohe C2-Symmetrie der Proteinstruktur in Verbindung mit interessanten Aminosäurepositionen am katalytischen Pol des (βα)8-Barrel-Proteins ließen jedoch die Aussichten für die Erzeugung von C2-symmetrischen Hybridkatalysatoren günstig erscheinen.
Im zweiten Teil dieser Arbeit sollte Sym2 enzymatisch aktiviert werden. Dazu wurde zunächst die Bindung von rCdRP, einem Produktanalogon der PRA-Isomerase-Reaktion, durch rationales Design etabliert. Der folgende Vergleich mit der PRAI-aktiven Variante HisF-D130V+D176V zeigte, dass sich die rCdRP-bindende Variante Sym2_bindC nur in vier (βα)-Einheiten von HisF-D130V+D176V unterschied. Zur Aktivierung sollten deshalb diese vier Einheiten einer Zufallsmutagenese unterzogen werden. Um die Erstellung der Genbank zu erleichtern, wurde Sym2_bindC circulär permutiert und das Gen für das resultierende Protein cpSym2_bindC zufällig mutiert. Die erstellte Genbank wurde anschließend in vivo auf PRAI-aktive Varianten selektiert. Durch eine Reduktion von überflüssigen Mutationen erhielt man schließlich mit cpSym2_TrpF ein hoch symmetrisches Protein, welches in vitro PRAI-Aktivität zeigt. Das Protein konnte kristallisiert und Ursachen für die katalytische Aktivität festgestellt werden. Die enzymatische Aktivierung stellt damit den Abschluss der experimentellen Rekonstruktion der (βα)8-Barrel-Evolution im Labor dar.
In einem weiteren Teil dieser Arbeit sollte das Konzept, ein C2-symmetrisches Protein zur Erzeugung von enantioselektiven Hybridkatalysatoren zu verwenden, getestet werden. Dazu sollten auf Basis des Sym2-Proteingerüsts durch Konjugation mit einem organischen Liganden Hybridproteine erstellt werden. Um die C2-Symmetrie zu erhalten wurde die Strategie der doppelten Verankerung gewählt. Da diese zu unerwünschten Oligomerisierungen führen kann, wurde als Proteingerüst nur eine Hälfte von Sym2 (hSym2) verwendet und die Konjugation unter denaturierenden Bedingungen durchgeführt. Es wurde ein Mn-Salen-Ligand mit Methylthiosulfonat-Gruppen zur Kopplung an Cysteine synthetisiert und mit verschiedenen Cystein-Varianten des Halbbarrel-Proteins hSym2 konjugiert. Die Konjugation wurde mittels Gelfiltration unter denaturierenden Bedingungen analysiert. Bei der anschließenden Rückfaltung lagerten sich die beiden Halbbarrel-Proteinketten zusammen und inkorporierten den Liganden in der Struktur. Mit den erhaltenen Hybridkatalysatoren wurde anschließend die Sulfoxidation von Thioanisol katalysiert und mittels HPLC analysiert. Dabei zeigte sich, dass keine der erstellten Varianten zufriedenstellende Reaktionsraten und Enantioselektivitäten erzielen konnte. Auch die Erstellung weiterer Varianten und die Verwendung von verschiedenen Lösungsmitteln und Puffern brachte keine signifikante Verbesserung. Schließlich konnte das Hybridprotein hSym2-D9C_Mn Salen kristallisiert werden. Die Struktur des Proteins zeigte, dass der Mn-Salen-Ligand überraschenderweise unter Freisetzung von Ethylendiamin und Spaltung des Liganden in zwei Hälften mit dem Protein reagierte. Das resultierende Hybridprotein konnte kein Mn binden, wodurch sich die schlechten katalytischen Eigenschaften erklären ließen. Eine Eliminierung aller Lysinreste im Umfeld der zur Konjugation verwendeten Cysteinreste lässt darauf hoffen, dass der Mn-Salen-Ligand intakt eingebaut werden kann und so eine enantioselektive Katalyse möglich wird.
Translation of the abstract (English)
This thesis focused on the artificial (βα)8-barrel protein Sym2. Sym2 is a thermostable protein with two-fold symmetry. It was generated during the laboratory reconstruction of (βα)8-barrel evolution which was based on the hypothesis that contemporary (βα)8-barrel enzymes arouse via duplication, fusion and diversification from a common (βα)4-halfbarrel ancestor. In order to mimic this process in ...
Translation of the abstract (English)
This thesis focused on the artificial (βα)8-barrel protein Sym2. Sym2 is a thermostable protein with two-fold symmetry. It was generated during the laboratory reconstruction of (βα)8-barrel evolution which was based on the hypothesis that contemporary (βα)8-barrel enzymes arouse via duplication, fusion and diversification from a common (βα)4-halfbarrel ancestor.
In order to mimic this process in the laboratory, the C-terminal (βα)4-halfbarrel HisF-C of the imidazole glycerol phosphate synthase HisF from the hyperthermophilic bacterium T. maritima was duplicated and fused in tandem, yielding HisF-CC. HisF-CC was then stabilized by a combination of rational design and directed evolution, yielding Sym1. Although the X-ray structure of the artificial and catalytically inactive (βα)8-barrel protein Sym1 could be elucidated, the termini of the two fused half-barrels were not resolved. For this reason Sym1 was further stabilized by replacing βα-module 8 from HisF-C with the stable βα-module 4 stemming from the N-terminal part of HisF; the resulting protein was termed Sym2.
In the first part of this thesis Sym2 was crystallized. The analysis of the structure showed that a symmetric salt-bridge cluster and hydrophobic interactions caused by pi-stacking were responsible for the enhanced stability of Sym2 compared to Sym1. Furthermore, the structural analysis revealed that the distances between the two phosphate binding sites and the catalytic important aspartate residues are different compared to HisF, which explained the inability of Sym2 to catalyze the HisF reaction.
The aim of the second part of this thesis was to enzymatically activate Sym2. To this end, binding of rCdRP, a product analogue of the PRA-isomerase reaction was established via rational design in a first step. The following comparison with the PRAI-active variant HisF-D130V+D176V revealed that the rCdRP binding variant Sym2_bindC differs in four (βα)-modules from HisF-D130V+D176V. Hence, in order to activate Sym2_bindC these four modules should be subjected to random mutagenesis. Sym2_bindC was circularly permuted to facilitate error-prone PCR. Subsequently, the N-terminal half of the resulting gene cpSym2_bindC was randomly mutated and a mutant library was constructed. Selection for PRA isomerase active variants in vivo, followed by a reduction of non-essential mutations yielded cpSym2_TrpF, a highly symmetric protein that shows in vitro PRA isomerase activity. Moreover, analysis of the crystal structure of cpSym2_TrpF provided hints for the activating effects of the mutations for catalytic activity. Together, the activation of Sym2 represents the final step in the laboratory reconstruction of (βα)8-barrel evolution.
The concept of using a C2-symmetrical protein scaffold to generate enantioselective hybrid catalysts was the topic of the third part of this thesis. Sym2 was conjugated with an organic ligand using a dual anchoring strategy that yielded hybrid proteins with retained C2-symmetry. To avoid the formation of oligomeric side products, only one half of Sym2 (hSym2) was used and the conjugation reaction was performed under denaturing conditions. Different cysteine variants of hSym2 were conjugated with a synthesized Mn-Salen ligand and the linkage was analyzed via size exclusion chromatography under denaturing conditions. Subsequently, the proteins were refolded and thus incorporated the ligand in their catalytic center. The generated hybrid proteins were then used to catalyze the sulfoxidation of thioanisole, and the reaction process was analyzed via HPLC. None of the catalysts showed adequate reaction rates and enantioselectivites, and neither the production of further variants nor the variation of solvent conditions could improve the catalytic properties. Crystallization of hSym2-D9C_Mn-Salen showed that the Mn-Salen ligand reacted with lysine residues of the protein with the result that the ligand was split in two halves. Accordingly, the ability of the hybrid proteins to bind the catalytically essential manganese ion was abolished, thus explaining the poor catalytic properties. Elimination of all lysine residues adjacent to the introduced cysteine residues should lead to the correct incorporation of the ligand and render the reaction enantioselective.
Metadata last modified: 26 Nov 2020 02:02
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