Isolation of kaempferol glycosides from Ginkgo biloba leaves and synthesis, identification and quantification of their major in vivo metabolites

URN to cite this document:: urn:nbn:de:bvb:355-epub-294253
DOI to cite this document:: 10.5283/epub.29425

Bücherl, Daniel

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Date of publication of this fulltext: 03 Feb 2014 14:05

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Item type:	Thesis of the University of Regensburg (PhD)
Open Access Type:	Primary Publication
Date:	3 February 2014
Referee:	Prof. Dr. Jörg Heilmann
Date of exam:	29 November 2013
Institutions:	Chemistry and Pharmacy > Institute of Pharmacy > Pharmaceutical Biology (Prof. Heilmann)
Keywords:	kaempferol glucuronide, synthesis, identification, quantification
Dewey Decimal Classification:	500 Science > 540 Chemistry & allied sciences 600 Technology > 615 Pharmacy
Status:	Published
Refereed:	Yes, this version has been refereed
Created at the University of Regensburg:	Yes
Item ID:	29425

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Abstract (English)

Abstract (English)

Flavonoids are secondary metabolites and almost ubiquitous in many edible plants and thus part of a healthy nutrition. They can be found mainly as glycosides in fruits and other vegetables, but also in some herbal medicines like Tebonin®, which active ingredient is an extract from the leaves of Ginkgo biloba. Following to the oral ingestion, these flavonoid glycosides are hydrolyzed in the small intestine. After absorption to the epithelium, the generated aglycone can be conjugated for instance with methyl-, sulfate- or glucuronic acid groups (phase-II-metabolism). This derivatisation initialize the excretion via kidney or bile but also results in a distribution of these metabolites in the body via the blood circulation. Consequently these flavonoid derivatives have the ability to reach several organs and tissues.
Flavonoids are known to have many benefical effects on health, but whether just the aglycones or also the in vivo conjugates are responsible is not always obvious. These is partly based in the lack of knowledge concerning the in vivo status of the metabolites in the tissues. The questions arises whether conjugates or maybe deconjugated metabolites are substrates for certain enzymes in tissues or organs.
In this work, the main phase-II-metabolites of kaempferol glycosides were identified and quantified in rat plasma. To achive this, the expected metabolites were chemically synthesized and used as reference substance in HPLC analysis. The different kaempferol glycosides for oral application were isolated from flavonol-enriched fractions of the Ginkgo folium extract EGb 761® obtained from Dr. Willmar Schwabe GmbH & Co. KG. Single kaempferol glycosides were orally administred to male Spraque Dawley rats, respectively. Finally, kaempferol-3-O-beta-D-glucuronide, kaempferol-7-O-beta-D-glucuronide and a kaempferol glucuronide-sulfate could be identified as the main metabolites after oral application of kaempferol rutinoside to rats.
The pharmacological investigation of kaempferol and some synthezised derivatives by the neuroprotectivity/neurotoxicity assay, but especially by the ORAC assay, confirmed the frequently mentioned anti-oxidative activity, wherein the aglycone showed the highest capacity. Also an anti-proliferative activity was detected for kaempferol, whereas the conjugates did not show any significant activity in this cell based assay. Similar results were obtained for the inhibition of ICAM-1 expression were just the aglycone showed a weak activity.

Translation of the abstract (German)

Flavonoide sind sekundäre Metabolite in Pflanzen und somit unter anderem Bestandteil einer gesunden Ernährung. In Gemüse und Früchten kommen vor allem die Glycoside dieser Verbindungen vor. Weiterhin findet man Flavonoide in vielen Phytopharmaka wie beispielsweise Tebonin®, dessen aktiver Inhaltsstoff ein Extrakt aus Ginkgo biloba Blättern darstellt. Nach oraler Aufnahme werden diese Flavonoidglycoside im Dünndarm hydrolisiert und können über das Dünndarmepithel aufgenommen werden. Der Aufnahme schließt sich eine Derivatisierung an, d.h. die entstandenen Aglykone werden z.B. mit einer Methyl-, Sulfat- oder Glucuronsäure-Gruppe konjugiert (Phase-II-Metabolismus). Der Grund für diese Substitution liegt grundsätzlich darin, die Substanz für die Exkretion über Niere oder Galle zugänglich zu machen, führt aber auch zu einer Aufnahme und Verteilung der Metabolite über den Blutkreislauf. Somit sind diese Verbindungen in der Lage zahlreiche Organe und Gewebe des Körpers erreichen.
Einige gesundsheitsfördernde Eigenschaften von Flavonoiden wurden bereits gezeigt, aber ob diese Effekte auf das Aglykon oder auch auf die Phase-II-Metabolite zurückzuführen sind ist bisher nicht eindeutig geklärt. Dies liegt unter anderem auch daran, dass in-vivo nicht genau bekannt ist, ob und vor allem in welchem Ausmaß die Konjugate in den Geweben wieder zu den Aglykonen umgesetzt werden.
In dieser Arbeit wurden die wichtigsten Phase-II-Metabolite von verschiedenen Kämpferolglykosiden im Plasma von Ratten identifiziert und quantifiziert. Um dies zu ermöglichen, wurden die erwarteten Metabolite chemisch synthesiert und als Referenzsubstanzen für die HPLC-Analyse genutzt. Für die orale Applikation wurden vier Kämpferolglycoside aus mit Flavonolen angereicherten Fraktionen des Ginkgo folium Extraktes EGb 761® isoliert, welche von der Dr. Willmar Schwabe GmbH & Co. KG bereitgestellt wurden. Nach oraler Applikation der Glykoside an männliche Spraque Dawley Ratten konnten Kämpferol-3-O-beta-D-glucuronid, Kämpferol-7-O-beta-D-glucuronid and ein Kämpferol Glucuronid/Sulfat als Hauptmetabolite identifiziert bzw. nach der Gabe von Kämpferolrutinosid auch teilweise quantifiziert werden.
Die Untersuchung von Kämpferol und einiger der synthetisierten Phase-II-Metabolite mittels des Neuroprotektivität/Neurotoxizität Assays, aber vor allem des ORAC Assays, bestätigte die oftmals erwähnte antioxidative Aktivität, insbesondere bzgl. des Aglykons. Dieses zeigt sowohl antiproliferative Eigenschaften als auch eine schwache Hemmung der ICAM-1 Expression. Die synthetisierten Konjugate des Kämpferols zeigten dagegen keine signifikante Aktivität in einem der durchgeführten zellbasierten Assays.

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