| License: Publishing license for publications including print on demand (50MB) |
- URN to cite this document:
- urn:nbn:de:bvb:355-epub-299904
- DOI to cite this document:
- 10.5283/epub.29990
| Item type: | Thesis of the University of Regensburg (PhD) |
|---|---|
| Open Access Type: | Primary Publication |
| Date: | 21 May 2014 |
| Referee: | Prof. Dr. Reinhard Sterner |
| Date of exam: | 13 May 2014 |
| Institutions: | Biology, Preclinical Medicine > Institut für Biophysik und physikalische Biochemie > Prof. Dr. Reinhard Sterner |
| Keywords: | Enzymes, ether lipids, Geranylgeranylglyceryl Phosphate Synthase, GGGPS, Heptaprenylglyceryl Phosphate Synthase, HepGPS, PcrB, Bacillus subtilis, Flavobacterium johnsoniae, Methanothermobacter thermautotrophicus, protein structure, crystallization, oligomerization, quarternary structure, dimerization, hexamerization, anchor amino acid, homology, functional assignment, key enzyme, evolution of Archaea, membrane lipids, phylogenetics, sequence similarity network, substrate specificity, stereo-selective catalysis, protein engineering, unnatural amino acid, non-canonical amino acid, p-azido-L-phenylalanine, protein cross-linking, PresCont, Rosetta, radioactive labelling, protein analytics, (βα)8-barrel |
| Dewey Decimal Classification: | 500 Science > 570 Life sciences |
| Status: | Published |
| Refereed: | Yes, this version has been refereed |
| Created at the University of Regensburg: | Yes |
| Item ID: | 29990 |
Abstract (English)
A characteristic difference between the three phylogenetic domains of life is the chemical composition of the lipids forming their cell membranes. In Bacteria and Eukarya phospholipids are based on a sn-glycerol-3-phosphate (G3P) which is esterified with two fatty acids, while in phospholipids from Archaea the enantiomer sn-glycerol-1-phosphate (G1P) forms two ether-bonds with isoprenoid chains. ...
Abstract (English)
A characteristic difference between the three phylogenetic domains of life is the chemical composition of the lipids forming their cell membranes. In Bacteria and Eukarya phospholipids are based on a sn-glycerol-3-phosphate (G3P) which is esterified with two fatty acids, while in phospholipids from Archaea the enantiomer sn-glycerol-1-phosphate (G1P) forms two ether-bonds with isoprenoid chains. As a result of these differences, the chemical, physical and biological properties of the archaeal membranes are drastically altered compared to bacterial and eukaryotic membranes. These changed conditions have been considered to be crucial for separation of archaea from a bacteria-like last universal common ancestor (LUCA). Consequently, the two enzymes that provide stereo-specificity in the synthesis of archaeal phospholipids have been regarded as key enzymes in the early evolution of Archaea and have been assumed to be strictly archaea-specific. These are the G1P-providing enzyme, glycerol-1-phosphate dehydrogenase (G1PDH), and the enzyme transferring an activated polyprenyl substrate (mostly geranylgeranyl diphosphate, GGPP) stereo-specifically to G1P, geranylgeranylglyceryl phosphate synthase (GGGPS). In contradiction to the presumed restriction of GGGPS occurrence to the domain of Archaea, genome sequencing data recently revealed a significant distribution of these enzymes among Bacteria. A phylogenetic analysis of GGGPS-like enzymes showed their partition into two distinct groups (group I and II), both comprising archaeal and bacterial sequences. Group I contains bacterial sequences from Gram-positive Firmicutes and group II from Gram-negative Bacteroidetes. While several bacterial and archaeal group I enzymes have been subjects of recent extensive kinetic and structural analyses, only a few archaeal, but no bacterial group II enzymes have been characterized up to now.
The aim of this work was a systematic comparative characterization of representative members from all important subgroups of the family of GGGPS-like enzymes, with a strong focus on the functional assignment of the Bacteroidetes subgroup and the structure-function-relationship in group II enzymes. Therefore, the variability within the family was analyzed in detail by calculating a sequence similarity network, and 17 representative GGGPS-like enzymes were characterized biochemically regarding their catalytic activities and substrate specificities. Three complementary assays demonstrated that all tested archaeal enzymes preferred short chained polyprenyl substrates, certainly being GGPP in most species. The bacterial enzymes from group II showed a preference for short chained polyprenyl substrates comparable to the archaeal enzymes, but the physiological role of the ether lipid product in those species remains an enigma. In contrast, bacterial enzymes from group I preferred long chained polyprenyl substrates, and a previous study has showed that the Bacillus subtilis enzyme produces heptaprenylglyceryl phosphate, which becomes dephosphorylated and acetylated in vivo.
Moreover, the first crystal structures of group II archaeal and bacterial enzymes have been solved within the framework of this thesis. These new structures expanded the knowledge on the mechanism of substrate specificity. In all GGGPS-like enzymes, the length of the polyprenylic substrate is measured by a “hydrocarbon ruler” that uses different residues to act as limiters in the binding pocket to provide the different substrate specificities. Interestingly, these limiter residues also differ between the GGPP-specific group I and group II enzymes.
Ongoing ambiguities on the native oligomerization interface of the group I enzyme from B. subtilis, PcrB, were resolved by means of a combined approach including computational, biophysical and biochemical methods. Mutagenesis-mediated monomerization identified the native interface among two computationally predicted alternatives. The result was verified by site-specific incorporation of an unnatural amino acid, which allowed for cross-linking when located in the native interface. Interestingly, monomerization did not affect thermal stability of PcrB, but limited the length of accepted polyprenyl diphosphates to three isoprene units in an in vitro assay, whereas the native substrate contains seven isoprene entities. A plausible hypothesis how dimerization determines substrate specificity of PcrB by affecting its secondary structure could be provided.
While these experiments confirmed that all group I enzymes and a number of group II enzymes share the same dimeric architecture, it was surprising that a significant portion of archaeal and bacterial group II enzymes revealed to be hexamers, as shown by crystallization and static light scattering experiments. In a rational mutagenesis study, which was aided by the novel structures, an aromatic “anchor” residue was found to be an inevitable prerequisite for hexamerization. By substituting this aromatic residue, the hexamers could be disrupted to dimers in the prototypical conformation. Because these dimeric mutants showed catalytic activities and thermal stabilities comparable to the hexameric wild types, the functional reason for hexamerization remains unclear.
In summary, the presented systematic comparative characterization leads to a deepened understanding of the mechanisms of substrate specificity and stereo-selectivity and a detailed description of the enzyme architecture in the two subgroups of the family of GGGPS-like enzymes.
Translation of the abstract (German)
Ein charakteristisches Unterscheidungsmerkmal zwischen den drei Domänen des Lebens ist die Zusammensetzung ihrer Zellmembranen. Die Phospholipide von Bakterien und Eukaryoten basieren auf sn-Glycerin-3-Phosphat (G3P), welches mit zwei Fettsäuren verestert ist, während in den Phospholipiden von Archaeen das Enantiomer sn-Glycerin-1-Phosphat (G1P) zwei Etherbindungen mit Isoprenolen ausbildet. ...
Translation of the abstract (German)
Ein charakteristisches Unterscheidungsmerkmal zwischen den drei Domänen des Lebens ist die Zusammensetzung ihrer Zellmembranen. Die Phospholipide von Bakterien und Eukaryoten basieren auf sn-Glycerin-3-Phosphat (G3P), welches mit zwei Fettsäuren verestert ist, während in den Phospholipiden von Archaeen das Enantiomer sn-Glycerin-1-Phosphat (G1P) zwei Etherbindungen mit Isoprenolen ausbildet. Folglich unterscheiden sich die chemischen, physikalischen und biologischen Eigenschaften archaeeller Membranen drastisch zu bakteriellen und eukaryotischen Membranen. Man nimmt an, dass diese veränderten Bedingungen entscheidend für die Abspaltung der Archaeen von einem bakterienartigen, letzten gemeinsamen Vorfahren (last universal common ancestor, LUCA) waren. Folglich werden die beiden Enzyme, die Stereospezifität in der Synthese der archaeellen Phospholipide vermitteln, als Schlüssel-Enzyme in der frühen Evolution der Archaeen betrachtet und wurden bisher als strikt Archaeen-spezifisch angesehen. Diese sind das G1P-bereitstellende Enzym, Glycerin-1-Phosphat-Dehydrogenase (G1PDH), und die Geranylgeranylglycerylphosphat Synthase (GGGPS), welche ein aktiviertes Polyprenyl-Substrat (meistens Geranylgeranylpyrophosphat, GGPP) stereospezifisch auf G1P überträgt. Entgegen der allgemein angenommenen Beschränkung des Vorkommens der GGGPS auf die Domäne der Archaeen haben Genomsequenzierungsdaten in der letzten Zeit eine signifikante Verbreitung dieser Enzyme unter Bakterien gezeigt. Eine phylogenetische Analyse von GGGPS-artigen Enzymen zeigte ihre Spaltung in zwei distinkte Gruppen (Gruppe I und II), die beide archaeelle und bakterielle Sequenzen umfassen. Gruppe I enthält bakterielle Sequenzen von Gram-positiven Firmicutes und Gruppe II enthält Sequenzen von Gram-negativen Bacteroidetes. Während in jüngster Zeit verschiedene bakterielle und archaeelle Enzyme aus der Gruppe I Gegenstand eingehender kinetischer und struktureller Analysen waren, wurden aus der Gruppe II bisher nur wenige archaeelle und keine bakteriellen Enzyme charakterisiert.
Ziel dieser Arbeit war eine systematische, vergleichende Charakterisierung von repräsentativen Mitgliedern aller wichtigen Untergruppen der Familie der GGGPS-artigen Enzyme, mit einem starken Fokus auf die Funktionsaufklärung der Bacteroidetes-Untergruppe sowie auf die Struktur-Funktions-Beziehungen in Gruppe II-Enzymen. Hierzu wurde die Variabilität in der Familie durch Berechnung eines Sequenzähnlichkeits-Netzwerkes detailliert analysiert, und 17 repräsentative GGGPS-artige Enzyme wurden biochemisch hinsichtlich ihrer katalytischen Aktivität und Substratspezifität charakterisiert. Drei komplementäre Tests zeigten, dass alle archaeellen Enzyme kurzkettige Polyprenyl-Pyrophosphate als Substrat bevorzugten, welches in den meisten Spezies sehr wahrscheinlich GGPP ist. Die bakteriellen Enzyme aus Gruppe II zeigten ebenso eine Präferenz gegenüber kurzkettigen Polyprenylsubstraten, vergleichbar zu den archaeellen Enzymen. Die physiologische Rolle der Etherlipidprodukte in diesen Spezies bleibt unbekannt. Bakterielle Enzyme der Gruppe I bevorzugten dagegen langkettige Polyprenylsubstrate, und eine vorangehende Studie konnte zeigen, dass das Enzym aus Bacillus subtilis Heptaprenylglycerylphosphat produziert, welches in vivo dephosphoryliert und acetyliert wird.
Weiterhin wurden im Rahmen dieser Arbeit die ersten Kristallstrukturen von Gruppe II-Enzymen gelöst. Diese neuen Strukturen erweiterten das Wissen über den Mechanismus der Substratspezifität. In allen GGGPS-artigen Enzymen wird die Länge des Polyprenylsubstrates durch einen „hydrocarbon ruler“ („Kohlenwasserstoff-Lineal“) gemessen, welches verschiedene Residuen in der Bindetasche als „limiter“ (Begrenzer) nutzt, um die unterschiedlichen Substratspezifitäten zu ermöglichen. Interessanterweise unterscheiden sich diese Residuen auch zwischen GGPP-spezifischen Enzymen der Gruppe I und II.
Mithilfe eines kombinierten Ansatzes aus bioinformatischen, biophysikalischen und biochemischen Methoden konnten andauernde Unklarheiten bezüglich der nativen Oligomerisierungs-Kontaktfläche des Gruppe I Enzyms aus B. subtilis, PcrB, geklärt werden. Mittels mutagenesevermittelter Monomerisierung konnte die native Kontaktfläche unter zwei bioinformatisch vorhergesagten Alternativen identifiziert werden. Das Ergebnis wurde durch ortsspezifischen Einbau einer nichtkanonischen Aminosäure verifiziert, welche bei Lokalisierung in der nativen Kontaktfläche ein Quervernetzen der Untereinheiten erlaubte. Interessanterweise beeinflusste die Monomerisierung nicht die thermische Stabilität von PcrB, aber limitierte in einem in vitro Test die Länge der akzeptierten Polyprenylpyrophosphate auf drei Isopreneinheiten, während das native Substrat sieben Isopreneinheiten enthält. Eine plausible Hypothese konnte aufgestellt werden, wie die Dimerisierung die Substratspezifität von PcrB durch Beeinflussung von dessen Sekundärstruktur bedingt.
Während diese Experimente bestätigten, dass alle Enzyme der Gruppe I und einige der Gruppe II eine gemeinsame Dimer-Architektur aufweisen, war es überraschend, dass eine erhebliche Anzahl an archaeellen und bakteriellen Gruppe II Enzymen Hexamere bilden, wie durch Kristallisations- und Lichtstreuungsexperimente gezeigt werden konnte. In einer durch die neuen Strukturen unterstützten Mutagenesestudie konnte eine aromatische „Anker“- Residue als unabdingbare Voraussetzung für die Hexamerisierung identifiziert werden. Durch Austausch dieser aromatischen Residue konnten die Hexamere in Dimere mit prototypischer Konfiguration getrennt werden. Da diese Dimer-Mutanten zum Wildtyp vergleichbare katalytische Aktivitäten und thermische Stabilitäten zeigten, bleibt der funktionelle Grund der Hexamerisierung vorerst unklar.
Zusammenfassend führt die vorgelegte systematische Charakterisierung zu einem vertieften Verständnis der Mechanismen der Substratspezifität und der Stereoselektivität sowie zu einer detaillierten Beschreibung der Enzym-Architektur in den zwei Untergruppen der Familie der GGGPS-artigen Enzyme.
Metadata last modified: 26 Nov 2020 01:06
Owner only: item control page
Download Statistics