| Lizenz: Veröffentlichungsvertrag für Publikationen mit Print on Demand (4MB) |
- URN zum Zitieren dieses Dokuments:
- urn:nbn:de:bvb:355-epub-312922
- DOI zum Zitieren dieses Dokuments:
- 10.5283/epub.31292
| Dokumentenart: | Hochschulschrift der Universität Regensburg (Dissertation) |
|---|---|
| Open Access Art: | Primärpublikation |
| Datum: | 2 Februar 2016 |
| Begutachter (Erstgutachter): | Prof. Dr. Armin Buschauer |
| Tag der Prüfung: | 30 Januar 2015 |
| Institutionen: | Chemie und Pharmazie > Institut für Pharmazie > Lehrstuhl Pharmazeutische / Medizinische Chemie II (Prof. Buschauer) |
| Stichwörter / Keywords: | GPCR, Arrestin, G-Protein, funktionelle Selektivität, biased agonism, pharmacological characterization, functional selectivity |
| Dewey-Dezimal-Klassifikation: | 600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften > 615 Pharmazie |
| Status: | Veröffentlicht |
| Begutachtet: | Ja, diese Version wurde begutachtet |
| An der Universität Regensburg entstanden: | Ja |
| Dokumenten-ID: | 31292 |
Zusammenfassung (Englisch)
Progress in our understanding of GPCRs and the functional versatility of these signal transduction machineries requires an extension of the methodology used for ligand characterization to account for alternate signaling pathways. This thesis aimed at the establishment of an arrestin recruitment assay to allow the characterization of newly developed ligand classes with respect to alternate, ...
Zusammenfassung (Englisch)
Progress in our understanding of GPCRs and the functional versatility of these signal transduction machineries requires an extension of the methodology used for ligand characterization to account for alternate signaling pathways. This thesis aimed at the establishment of an arrestin recruitment assay to allow the characterization of newly developed ligand classes with respect to alternate, arrestin mediated signaling pathways.
The optimized luciferase complementation assay proved to be a fast and reliable method to investigate ligand induced arrestin recruitment to GPCRs. By the chosen modular approach, the assay can be easily adapted to a plethora of GPCR targets. This thesis demonstrated the feasibility of an EFC (Enzyme Fragment Complementation) based arrestin recruitment assay at five distinct GPCRs, the histamine receptor subtypes HR1RR, HR2RR and HR4RR and the neuropeptide Y (NPY) receptors YR1RR and YR2RR. For all receptors, HEK293T cell lines were generated, stably expressing the receptor-ELucC and either the ELucN-Arr1 or ELucN-Arr2 fusion construct, respectively. All five receptors coupled to both arrestin isoforms, although the absolute signal intensity differed considerably for the different receptors. All cell lines produced an excellent signal-to noise ratio in the luciferase complementation assay, thus providing a suitable platform for the characterization of compound libraries to identify functionally selective ligands.
For the characterization of the NPY receptors YR1RR and YR2RR a selection of subtype-selective nonpeptidic ligands, including several structurally divers antagonists described in literature as well as a set of argininamide type antagonists, was available. At the YR1RR, neither the commercially available antagonists, nor the argininamide type BIBP3226 or BIBO3304 derivatives exhibited significant efficacy regarding arrestin recruitment. Concerning arrestin and G-protein mediated pathways, none of these compounds exhibited a functional bias. Likewise, none of the selected YR2RR antagonists revealed functional selectivity towards arrestin recruitment. Therefore, these results do not support the assumption that the insurmountable antagonism previously reported for this compound class, is due to ligand specific receptor conformations.
In case of the histamine HR1RR, the ligand selection comprised a set of structurally diverse HR1RR antagonists, including approved drugs for the treatment of allergic or mental disorders, and several phenylhistamine and histaprodifen type agonists. Whereas none of the antagonists exhibited functional bias, several chiral histaprodifen derivatives were identified as arrestin biased ligands. Interestingly, these compounds also discriminated between the two arrestin isoforms, with a preference for -arrestin 2. Functional screening for selectivity at the HR2RR identified a set of acyl- or carbamoylguanidine type ligands as G-protein biased agonists. Several of these compounds behaved as full agonists in the G-protein readout, whereas their efficacy was markedly lower in the arrestin recruitment assay. At the HR4RR a set of 30 structurally diverse ligands was investigated. Regarding their efficacy, several of these compounds exhibited G-protein bias. On the contrary, arrestin bias was only confirmed in case of the known, functionally selective, ligand JNJ7777120. The findings at the HR2RR and HR4RR were verified using a bias quantification approach based on the operational model of agonism. This method allows the integration of both efficacy and potency information derived from the concentration response data into a single bias value, thereby enabling the elucidation of structure activity relationship to guide the development of biased ligands.
With increasing insight into the physiological implications of arrestin mediated signaling, biased agonism has gained interest as a new means to fine-tune drug action towards a desired outcome. Observations in this thesis emphasize the necessity of full characterization of newly designed compounds classes with regard to their functional behavior towards alternate pathways. The established arrestin recruitment assay, in combination with various G-protein based readouts and holistic, label free assay systems, established in our research group, will allow the comprehensive exploration of the majority of putative signaling outcomes.
Übersetzung der Zusammenfassung (Deutsch)
Ziel dieser Arbeit war die Etablierung eines Arrestinrekrutierungsassays zur Charakterisierung neuer Ligandklassen in Bezug auf alternative, Arrestin vermittelte Signaltransduktionswege. Der optimierte Luciferase-Komplementationsassay hat sich als eine schnelle und zuverlässige Methode zur Untersuchung der ligandinduzierten Arrestinrekrutierung an GPCRs erwiesen. Durch den gewählten modularen ...
Übersetzung der Zusammenfassung (Deutsch)
Ziel dieser Arbeit war die Etablierung eines Arrestinrekrutierungsassays zur Charakterisierung neuer Ligandklassen in Bezug auf alternative, Arrestin vermittelte Signaltransduktionswege. Der optimierte Luciferase-Komplementationsassay hat sich als eine schnelle und zuverlässige Methode zur Untersuchung der ligandinduzierten Arrestinrekrutierung an GPCRs erwiesen. Durch den gewählten modularen Ansatz kann der Assay jederzeit für eine Vielzahl unterschiedlicher Rezeptoren adaptiert werden. Diese Arbeit demonstrierte die Machbarkeit eines EFC (Enzyme Fragment Complementation)-basierten Arrestinrekrutierungsassays an 5 unterschiedlichen GPCRs, den Histaminrezeptorsubtypen H1R, H2R und H4R sowie den Neuropeptid Y (NPY) Rezeptoren Y1R und Y2R. Für alle Rezeptoren wurden HEK293T Zellen so modifiziert, dass sie das Rezeptor-ElucC Fusionskonstrukt sowie entweder das ELucN-Arr1 oder ELucN-Arr2 Konstrukt stabil exprimieren. Jeder der 5 getesteten Rezeptoren interagierte mit beiden Arrestin Isoformen, wenngleich sich die Signalintensität deutlich zwischen den Rezeptoren unterschied. Das Signal-Rausch-Verhältnis lag bei allen Zellen auf hohem Niveau, so dass sie eine geeignete Basis für die Charakterisierung von Wirkstoffen und zur Identifizierung funktionell selektiver Liganden darstellen.
Aus der NPY Rezeptor Familie wurden in dieser Arbeit der Y1R sowie der Y2R untersucht, für die eine Auswahl an Subtyp-selektiven, nichtpeptidischen Liganden zur Verfügung stand. Diese Auswahl umfasste eine Reihe strukturell unterschiedlicher literaturbekannter Antagonisten sowie diverse Antagonisten des Argininamidtyps. Am Y1R zeigten weder die kommerziell erhältlichen Antagonisten, noch die von BIBP3226 und BIBO3304 abgeleiteten Argininamide signifikante Aktivität im Arrestinrekrutierungsassay. In Bezug auf Arrestin und G-Protein vermittelte Signalwege zeigte keiner dieser Liganden eine Präferenz. Ebenso zeigte keiner der ausgewählten Y2R Antagonisten funktionelle Selektivität für Arrestinrekrutierung. Diese Ergebnisse liefern somit keine Anhaltspunkte dafür, dass der für diese Substanzklasse beschriebene „insurmountable antagonism“ durch ligandspezifische Rezeptorkonformationen und eine Beteiligung von Arrestin hervorgerufen wird.
Im Falle des Histamin H1R umfasste die Ligandenauswahl eine Reihe strukturell unterschiedlicher Antagonisten, darunter mehrere zugelassene Arzneimittel für die Behandlung allergischer oder psychischer Erkrankungen, sowie mehrere Agonisten des Phenylhistamin- und des Histaprodifentyps. Während keiner der getesteten Antagonisten einen der untersuchten Signalwege bevorzugte, wurden einige chirale Histaprodifen-Derivate als arrestinselektive Liganden identifiziert. Interessanterweise zeigten diese Liganden auch eine Präferenz für -Arrestin 2, diskriminierten also zwischen den beiden Arrestinisoformen. Im Fall des H2R wurden eine Reihe von Liganden vom Acyl- und Carbamoylguanidintyp als G-Protein selektive Agonisten identifiziert. Mehrere dieser Verbindungen verhielten sich im G-Protein-abhängigen Assay als volle Agonisten, während sie im Arrestinrekrutierungsassay eine deutlich verringerte intrinsische Aktivität aufwiesen. Am H4R wurde eine Auswahl an 30 strukturell unterschiedlichen Liganden untersucht. In Bezug auf ihre intrinsische Aktivität wiesen einige dieser Verbindungen G-Protein-Präferenz auf. Arrestinselektivität konnte hingegen nur für den bekannten, funktionell selektiven Liganden JNJ7777120 bestätigt werden. Die Ergebnisse am H2R und H4R wurden mithilfe eines Quantifizierunsansatzes auf Basis des sogenannten „Operational Model of Agonism“ verifiziert. Diese Methode erlaubt es, einen Bias Faktor zu berechnen, der Informationen sowohl zur Potenz wie Effektivität der Liganden in den einzelnen Signalwegen enthält und es damit ermöglicht, Struktur-Wirkungs-Beziehungen aufzustellen, um die Entwicklung funktionell selektiver Liganden zu steuern.
Aufgrund der möglichen physiologischen Auswirkungen der arrestinvermittelten Signaltransduktion findet die funktionelle Selektivität von Wirkstoffen wachsendes Interesse in der Arzneimittelforschung. Die Ergebnisse dieser Arbeit unterstreichen die Notwendigkeit einer umfassenden Charakterisierung neuer Substanzklassen in Bezug auf die Beeinflussung alternativer Signalwege. Der etablierte Arrestinrekrutierungsassay, in Kombination mit bestehenden G-Protein basierten und holistischen, markierungsfreien Methoden, kann dazu einen wichtigen Beitrag leisten.
Metadaten zuletzt geändert: 26 Nov 2020 00:27
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