| License: Publishing license for publications excluding print on demand (6MB) |
- URN to cite this document:
- urn:nbn:de:bvb:355-epub-314379
- DOI to cite this document:
- 10.5283/epub.31437
| Item type: | Thesis of the University of Regensburg (PhD) |
|---|---|
| Open Access Type: | Primary Publication |
| Date: | 11 March 2016 |
| Referee: | Prof. Dr. Armin Buschauer |
| Date of exam: | 6 March 2015 |
| Institutions: | Chemistry and Pharmacy > Institute of Pharmacy > Pharmaceutical/Medicinal Chemistry II (Prof. Buschauer) |
| Keywords: | Bendamustin, ester, stability, cytotoxicity, breast cancer initiating cells, Topotecan, ABCG2 |
| Dewey Decimal Classification: | 600 Technology > 615 Pharmacy |
| Status: | Published |
| Refereed: | Yes, this version has been refereed |
| Created at the University of Regensburg: | Yes |
| Item ID: | 31437 |
Abstract (English)
ABC-transporter expression is a crucial mechanism of tumor resistance and was recently also associated with cancer initiating cells (CIC). Flow cytometry was applied to detect the expression of CIC-markers, ABCB1 and ABCG2 in human brain- and breast cancer cell lines and to examine possible correlations between ABC-transporter expression and CICs. Only one of the investigated brain tumor cell ...
Abstract (English)
ABC-transporter expression is a crucial mechanism of tumor resistance and was recently also associated with cancer initiating cells (CIC). Flow cytometry was applied to detect the expression of CIC-markers, ABCB1 and ABCG2 in human brain- and breast cancer cell lines and to examine possible correlations between ABC-transporter expression and CICs. Only one of the investigated brain tumor cell lines (Daoy) comprised cells expressing CIC-markers which revealed increased clonogenicity in vitro.
For investigations on the correlation between CICs and ABCG2, MCF-7 breast cancer cells were treated with topotecan (Topo) to induce ABCG2 expression. Topo treatment led to increased resistance against cytostatic drugs, which are substrates of ABCG2. Concurrently, Topo treatment induced a reversible decrease in the expression of the CIC-markers CD24 and EpCAM, but did not result in increased clonogenicity in vivo. In contrast, Topo treated cells revealed decreased tumorigenicity, most probably due to the down-regulation of CD24 and EpCAM. Nevertheless, further investigations are necessary to determine whether ABCG2 induction and CD24/EpCAM down-regulation are interrelated or independent processes.
The nitrogen mustard (N-Lost) derivative bendamustine (BM) has been approved as an anticancer drug for the treatment of hematopoietic malignancies for decades. Nevertheless, as becomes obvious from a series of recent publications and patent applications, there is increasing interest in this cytostatic with respect to, for example, improved oral bioavailability of BM by optimized formulations. Following a different approach, in this thesis the potential of esters of BM was explored, with a focus on representative aminoalkyl esters. Alkyl- and various aminoalkyl (e.g. 2-morpholinoethyl or 2-pyrrolidinoethyl) esters of BM were investigated for stability in various media and cytotoxicity in vitro against a broad panel of human malignancies.
For this purpose, a fast, selective RP-HPLC method using fluorescence detection was established and validated. This method enabled the separation of complex mixtures of analytes and degradation products with low limits of quantification and high accuracy and precision. Liquid phase extraction with perchloric acid yielded high recovery rates and proved to be applicable to the determination of the stability of BM and BM esters in biological material.
In aqueous solution, the half-life of the N-Lost moiety remained essentially unchanged upon esterification of BM. The N-Lost group was significantly more stable in murine plasma, whereas the ester bonds were prone to enzymatic cleavage. Interestingly, the nitrogen mustard group was even more stable in human than in murine plasma. The stability of the ester bond substantially depended on the chemical nature of the substituents at the ester group. Kinetic studies in the presence of plasma, butyrylcholine esterase and physostigmine revealed that the basic esters are substrates of unspecific choline esterases. While alkyl esters and the mofetil ester had significantly longer half-lives in human compared to murine plasma, basic esters, except for the branched 1-methyl-2-pyrrolidinoethyl ester, were cleaved rapidly. The discrepancies between the species-dependent stabilities of the BM derivatives can be attributed to lower albumin content and higher enzymatic activity in mouse compared to human plasma.
Surprisingly, cytotoxicity studies revealed that the BM derivatives possess considerably increased antiproliferative activity against a panel of human cancer cells, representing not only hematologic malignancies but also solid tumors (e.g. malignant melanoma, colorectal carcinoma and lung cancer), which are resistant to the parent compound BM. Although the investigated compounds are sufficiently stable to act as antitumor agents on their own, it cannot be precluded that the esters are prodrugs, allowing for increased intracellular accumulation of BM. Especially, basic esters, positively charged under physiological conditions, were up to approximately 100 times more effective than BM. This was paralleled by a higher fraction of early apoptotic cancer cells and increased expression of p53.
As HPLC analyses revealed cellular enrichment of the esters with the highest accumulation factor in case of the pyrrolidinoethyl ester, transport by organic cation transporters OCT1 and OCT3 was taken into account. Although differential interactions of the BM derivatives with these transporters were confirmed in vitro, the OCT expression (mRNA level) of the investigated human sarcoma and carcinoma cells did not support the hypothesis of an OCT mediated uptake contributing to the drastic increase in chemosensitivity.
The presented approach to increasing cellular access, enhancing antiproliferative activity – also against cancer cells refractory to the parent compound - by chemical derivatization might also add value to alkylating agents other than bendamustine.
Translation of the abstract (German)
Die Expression von ABC-Transportern ist nicht nur ein wesentlicher Mechanismus der Tumorresistenz, sondern wurde in der Vergangenheit auch mit Krebs-initiierenden Zellen (KIZ) in Verbindung gebracht. Zur Untersuchung möglicher Zusammenhänge zwischen der Expression von ABC-Transportern und KIZ wurde mittels Durchflusszytometrie die Expression von KIZ-Markern sowie von ABCB1 und ABCG2 in humanen ...
Translation of the abstract (German)
Die Expression von ABC-Transportern ist nicht nur ein wesentlicher Mechanismus der Tumorresistenz, sondern wurde in der Vergangenheit auch mit Krebs-initiierenden Zellen (KIZ) in Verbindung gebracht. Zur Untersuchung möglicher Zusammenhänge zwischen der Expression von ABC-Transportern und KIZ wurde mittels Durchflusszytometrie die Expression von KIZ-Markern sowie von ABCB1 und ABCG2 in humanen Hirntumor- und Brustkrebs-Zelllinien bestimmt. Nur in einer der untersuchten Hirntumor-Zelllinien (Daoy) wurden Zellen, die KIZ-Marker exprimierten und eine erhöhte Klonogenität in vitro zeigten, identifiziert.
Für Untersuchungen zur Korrelation zwischen KIZ und ABCG2 wurden MCF-7 Brustkrebszellen mit Topotecan (Topo) behandelt, um die Expression von ABCG2 zu induzieren. Dies führte zu einer erhöhten Resistenz gegen Zytostatika, die ABCG2-Substrate sind. Gleichzeitig führte die Behandlung mit Topo zu einer reversiblen Abnahme der Expression der KIZ-Marker CD24 und EpCAM, während die Klonogenität in vitro nicht zunahm. Im Gegensatz dazu erwiesen sich die mit Topo behandelten Zellen als weniger tumorigen, wahrscheinlich auf Grund der Abnahme der Expression von CD24 und EpCAM. Weitere Untersuchungen sind jedoch nötig um zu klären, ob die Induktion von ABCG2 und die Abnahme der Expression von CD24/EpCAM zusammenhängende oder unabhängige Prozesse sind.
Das N-Lost Derivat Bendamustin (BM) ist seit Jahrzehnten für die Behandlung hämatopoetischer Krebsarten zugelassen. Eine Serie neuer Publikationen und Patente verdeutlicht das wachsende Interesse an dieser Substanz, z.B. im Hinblick auf verbesserte orale Bioverfügbarkeit durch optimierte Formulierungen. Einem anderen Ansatz folgend wurden in dieser Arbeit sowohl Alkyl- als auch verschiedene Aminoalkylester (z.B. 2-Morpholinoethyl- und 2-Pyrrolidinoethylester) von BM auf ihre Stabilität in verschiedenen Medien sowie ihre Zytotoxizität gegen ein breites Spektrum humaner Krebsarten getestet.
Zu diesem Zweck wurde eine schnelle und selektive RP-HPLC Methode mit Fluoreszenzdetektion etabliert und validiert. Diese Methode ermöglichte die Trennung komplexer Mischungen von Analyten und Abbauprodukten mit niedrigen Bestimmungsgrenzen und einer hohen Genauigkeit und Präzision. Flüssigphasenextraktion mit Perchlorsäure lieferte hohe Wiederfindungsraten und erwies sich als geeignet für Stabilitätsuntersuchungen von BM und BM-Estern in Proben aus biologischem Material.
Die Halbwertszeit (HWZ) der N-Lost Gruppe in wässrigen Lösungen blieb unbeeinflusst von der Veresterung. In murinem Plasma war die N-Lost Gruppe signifikant stabiler, aber die Esterbindung anfällig für eine enzymatische Spaltung. Interessanterweise erwies sich die N-Lost Gruppe in humanem Plasma als noch stabiler als in murinem Plasma. Für die Stabilität der Esterbindung in humanem Plasma war die Art des Estersubstituenten entscheidend. Während Alkylester und der Mofetilester deutlich längere HWZ in humanem verglichen mit murinem Plasma zeigten, wurden die basischen Ester, abgesehen von dem verzweigten 1-Methyl-2-Pyrrolidinoethylester, schnell gespalten. Kinetische Studien in der Anwesenheit von Plasma, Butyrylcholinesterase und Physostigmin zeigten, dass die basischen Ester Substrate unspezifischer Cholinesterasen sind. Die speziesabhängigen Unterschiede in der Stabilität der BM Ester konnten dem niedrigeren Albumingehalt und der höheren enzymatischen Aktivität in murinem Plasma, verglichen mit humanem Plasma, zugeschrieben werden.
Zytotoxizitätsstudien zeigten, dass die BM Derivate eine deutlich höhere antiproliferative Aktivität gegen eine Vielzahl humaner Krebszellen, sowohl hämatologischen Ursprungs als auch gegen solide Tumoren, die resistent gegen BM sind (z.B. malignes Melanom, Kolorektalkarzinom, Lungenkrebs), haben. Obwohl die untersuchten Ester stabil genug sind, um selbst zytostatisch zu wirken, kann nicht ausgeschlossen werden dass sie als Prodrugs fungieren und eine gesteigerte zelluläre Aufnahme von BM ermöglichen. Insbesondere basische Ester, die unter physiologischen Bedingungen positiv geladen sind, waren ca. 100fach effektiver als BM. Dies ging einher mit einer erhöhten Fraktion apoptotischer Zellen sowie einer erhöhten Expression von p53.
Da HPLC Analysen eine gesteigerte zelluläre Anreicherung der Ester mit dem höchsten Akkumulationsfaktor für den Pyrrolidinoethylester ergaben, wurde der Transport durch organische Kationentransporter (OCT1, OCT3) untersucht. Obwohl unterschiedliche Interaktionen der BM Derivate mit diesen Transportern in vitro gezeigt werden konnten, lieferte die Analyse der OCT Expression (mRNA) keine Belege für die Hypothese einer OCT-vermittelten Aufnahme der BM Derivate.
Der dargestellte Ansatz, die zelluläre Aufnahme und dadurch die antiproliferative Aktivität - auch gegen Krebszellen, die immun gegen die Muttersubstanz sind – durch chemische Derivatisierung zu steigern, könnte auch auf andere Alkylantien übertragbar sein.
Metadata last modified: 26 Nov 2020 00:18
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