| License: Publishing license for publications excluding print on demand (7MB) |
- URN to cite this document:
- urn:nbn:de:bvb:355-epub-315173
- DOI to cite this document:
- 10.5283/epub.31517
| Item type: | Thesis of the University of Regensburg (PhD) |
|---|---|
| Date: | 30 March 2015 |
| Referee: | Prof. Dr. Armin Buschauer |
| Date of exam: | 13 March 2015 |
| Institutions: | Chemistry and Pharmacy > Institute of Pharmacy > Pharmaceutical/Medicinal Chemistry II (Prof. Buschauer) |
| Keywords: | constitutive activity, Sf9 cells, ligand binding, H4 receptor, H4 receptor orthologs, histamine, site-directed mutagenesis, GTP(gamma)S binding, radioligand binding, JNJ7777120, clozapine, isoloxapine, VUF8430, immepip, clobenpropit, thioperamide, UR-PI376, UR-PI294 |
| Dewey Decimal Classification: | 600 Technology > 615 Pharmacy |
| Status: | Published |
| Refereed: | Yes, this version has been refereed |
| Created at the University of Regensburg: | Yes |
| Item ID: | 31517 |
Abstract (English)
The histamine H4R belongs to the class A of G-protein coupled receptors (GPCRs) and is considered as a promising drug target for the treatment of inflammatory diseases such as allergic asthma. The validation of the H4R in translational animal models is compromised by species-dependent differences regarding intrinsic activities, potencies and affinities of ligands, in particular, when comparing ...
Abstract (English)
The histamine H4R belongs to the class A of G-protein coupled receptors (GPCRs) and is considered as a promising drug target for the treatment of inflammatory diseases such as allergic asthma. The validation of the H4R in translational animal models is compromised by species-dependent differences regarding intrinsic activities, potencies and affinities of ligands, in particular, when comparing the hH4R (human) and the rodent orthologs, i. e., the mH4R (mouse) and rH4R (rat). In contrast to the mH4R and rH4R, the hH4R shows a high degree of constitutive activity. Therefore, H4R species orthologs represent ideal candidates to study the phenomenon of “constitutive activity”. As working hypothesis of the present project, the aforementioned species-dependent differences were supposed to be determined by one or several distinct amino acids in the ligand binding pocket of the human H4R compared to the orthologs of mouse and rat.
Aiming at more detailed insights into the molecular determinants of ortholog-dependent ligand-receptor interactions, a series of H4R mutants were generated and expressed in Sf9 cells to determine and analyse radioligand binding and functional data ([35S]GTPγS assay) of selected ligands. In addition to F169, which was identified by Lim et al. as a key amino acid for distinct ligand binding affinities at H4R orthologs, suggested by molecular modelling studies, S179, S330 and R341 were replaced by the corresponding amino acids of the rodent H4Rs, resulting in hH4R-F169V, hH4R-S179M/A, hH4R-F169V+S179M/A, hH4R-S330R and hH4R-R341S. The reciprocal mH4R mutants, mH4R-V171F and mH4R-V171F+M181S, respectively, served as controls. Moreover, to study the role of the F168/F169 motif, which is also found in, e. g., the β2AR, H3R and the M2R, the mutated receptor protein hH4R-F168A was expressed in Sf9 cells. Additionally, R341 was replaced by the respective residue of the canine H4R, resulting in hH4R-R341E.
Comparable expression levels and ratios of receptor to G-protein expression in Sf9 cell membranes were confirmed by [3H]histamine saturation binding and SDS-PAGE, followed by Coomassie staining and western blotting.
Compared to the hH4R wild-type, especially UR-PI376, clozapine and isoloxapine revealed a significant decrease in potency and affinity at the hH4R-F169V single and the hH4R-F169V+A179M/A double mutants, respectively. The reverse mH4R mutants, mH4R-V171F and mH4R-V171F+M181S, respectively, became more hH4R-like. Moreover, the potency and/or affinity of most ligands was higher at the S179A than at the respective S179M mutants. Strikingly, the constitutive activity of the hH4R-F169V and the double mutants was significantly reduced compared to the wild-type hH4R. By contrast, an exchange of S179 by M or A alone did not significantly affect constitutive activity. The double mutants were comparable to the mH4R and to the rH4R, which are devoid of constitutive activity. The inverse agonism of thioperamide decreased from the hH4R via the hH4R-F169V mutant to the hH4R-F169V+S179M/A double mutants, respectively.
The data for the hH4R-F168A mutant revealed a major contribution of F168 to ligand binding with a concomitant, up to over 100-fold decrease in ligand potencies and a complete loss of constitutive activity, compared to the wild-type hH4R. Thioperamide acted as a neutral antagonist and JNJ7777120 turned to partial agonism.
Potencies and affinities of the ligands clozapine, isoloxapine and UR-PI376 slightly decreased at the hH4R-S330R mutant compared to the hH4R wild-type. Constitutive activities slightly decreased in case of the hH4R-S330R mutant.
Compared to the hH4R, the affinity of UR-PI376 increased at the hH4R-R341E mutant. The constitutive activity of the hH4R-R341S mutant decreased slightly.
Molecular modelling studies suggested that F168ECL2 and F169ECL2 interact with the surrounding hydrophobic and aromatic amino acids, which are supposed to be involved in the contraction of the binding pocket and, thus, in constitutive activity. S1795.43 was proposed to form an H-bond with T3236.55, which is precluded in case of mutation to M or A. S1795.43 alone was not the cause for the high constitutive activity of the hH4R. However, this amino acid in concert with F169ECL2 markedly contributes to the concomitant distal outward movement of TM5 and TM6.
In conclusion, especially F168 and F169 alone or F169 in concert with S179 favour the conversion of the inactive to the active state of the human H4R. The fact that comparable amino acids are present in equivalent positions of other constitutively active GPCRs such as the β2AR or the H3R suggest a common mechanism of receptor activation.
Translation of the abstract (German)
Der Histamin H4R gehört zur Klasse A der G-Protein gekoppelten Rezeptoren (GPCRs) und gilt als vielversprechendes biologisches Zielmolekül für neue Arzneistoffe zur Behandlung von entzündlichen Erkrankungen wie allergischem Asthma. Spezies-abhängige Unterschiede hinsichtlich intrinsischer Aktivitäten, Potenzen und Ligand-Affinitäten limitieren den Vorhersagewert translationaler Tiermodelle für ...
Translation of the abstract (German)
Der Histamin H4R gehört zur Klasse A der G-Protein gekoppelten Rezeptoren (GPCRs) und gilt als vielversprechendes biologisches Zielmolekül für neue Arzneistoffe zur Behandlung von entzündlichen Erkrankungen wie allergischem Asthma. Spezies-abhängige Unterschiede hinsichtlich intrinsischer Aktivitäten, Potenzen und Ligand-Affinitäten limitieren den Vorhersagewert translationaler Tiermodelle für den humanen H4R, insbesondere im Vergleich des hH4R mit den orthologen Rezeptoren der Maus (mH4R) und Ratte (rH4R). Im Gegensatz zu den mH4R und rH4R zeigt der hH4R ein hohes Maß an konstitutiver Aktivität. Daher sind H4R Spezies-Orthologe ideale Kandidaten für die Untersuchung des Phänomens der “konstitutiven Aktivität”. Die Arbeitshypothese des vorliegenden Projekts beruht auf der Annahme, dass die genannten Spezies-abhängigen Diskrepanzen durch eine oder mehrere unterschiedliche Aminosäuren in der Ligandbindungstasche des humanen H4R im Vergleich zu den orthologen Rezeptoren der Maus und der Ratte bestimmt werden.
Um Erkenntnisse über die molekularen Determinanten der Ortholog-abhängigen Ligand-Rezeptor-Interaktionen zu gewinnen, wurde eine Reihe von H4R Mutanten generiert und in Sf9 Zellen exprimiert. Anschließend wurden die Affinitäten (Radioligand-Bindungsdaten) und funktionellen Daten ausgewählter Liganden (Aktivität im [35S]GTPγS Assay) bestimmt und analysiert. Neben der von Lim et al. als Schlüsselaminosäure für unterschiedliche Ligand-Bindungsaffinitäten identifizierten Aminosäure F169, wurden - basierend auf Molecular Modelling Studien - S179, S330 und R341 durch die korrespondierenden Aminosäuren der Nager-H4-Rezeptoren ersetzt, sodass hH4R-F169V, hH4R-S179M/A, hH4R-F169V+S179M/A, hH4R-S330R und hH4R-R341S resultierten. Die reziproken mH4R Mutanten, mH4R-V171F und mH4R-V171F+M181S, dienten als Kontrollen. Darüber hinaus wurde die Rezeptormutante hH4R-F168A in Sf9 Zellen exprimiert, um die Rolle des F168/F169 Motivs, das z.B. auch im β2AR, H3R und dem M2R vorkommt, zu untersuchen. Des Weiteren wurde R341 durch die entsprechende Aminosäure des Hunde-H4R ausgetauscht (hH4R-R341E).
Das Expressionsniveau und das Verhältnis der Proteinmenge an Rezeptor zu G-Protein in Sf9 Membranen waren in allen Fällen vergleichbar. Dies wurde durch Sättigungsexperimente mit [3H]Histamin sowie mit SDS-PAGE, gefolgt von Coomassie Färbung und Western Blot, nachgewiesen.
Im Vergleich zu den Daten am humanen H4R Wildtyp zeigten insbesondere UR-PI376, Clozapin und Isoloxapin eine signifikante Abnahme der Potenz und der Affinität an der hH4R-F169V Einzelmutante und den hH4R-F169V+A179M/A Doppelmutanten. Die reversen mH4R Mutanten, mH4R-V171F und mH4R-V171F+M181S, zeigten ein dem hH4R ähnliches Verhalten. Darüber hinaus waren die Potenzen und/oder die Affinitäten der meisten Liganden an S179A höher als an den entsprechenden S179M Mutanten. Besonders augenfällig war eine starke Abnahme der hohen konstitutiven Aktivität des humanen H4R bei der hH4R-F169V und den Doppelmutanten. Im Gegensatz dazu wirkte sich der Austausch von S179 durch M oder A alleine nicht signifikant auf die konstitutive Aktivität aus. Die Doppelmutanten waren dem mH4R und dem rH4R, welche keine konstitutive Aktivität aufweisen, vergleichbar. Der invers agonistische Effekt von Thioperamid nahm vom hH4R über die hH4R-F169V Mutante zu den hH4R-F169V+S179M/A Doppelmutanten hin ab.
Die Daten für die hH4R-F168A Mutante zeigten, dass F168 wesentlich zur Ligandbindung beiträgt. Die Potenzen der untersuchten Liganden waren um mehr als den Faktor 100 reduziert. Gleichzeitig zeigte die Rezeptormutante keine konstitutive Aktivität mehr. Thioperamid wirkte als neutraler Antagonist, JNJ7777120 als Partialagonist.
Im Vergleich zum hH4R Wildtyp lagen die Potenzen und Affinitäten der Liganden Clozapin, Isoloxapin und UR-PI376 an der hH4R-S330R Mutante etwas niedriger. Die konstitutiven Aktivitäten verminderten sich geringfügig im Fall der hH4R-S330R Mutante.
Im Vergleich zum hH4R nahm die Affinität von UR-PI376 zur hH4R-R341E Mutante zu. Die konstitutive Aktivität der hH4R-R341S Mutante nahm geringfügig ab.
Die durchgeführten Molecular Modelling Studien sprechen dafür, dass F168ECL2 und F169ECL2 mit umgebenden hydrophoben und aromatischen Aminosäuren interagieren, welche vermutlich zur Kontraktion der Bindungstasche und damit zur Umwandlung der inaktiven in die aktive Konformation beitragen. Während S1795.43 eine Wasserstoffbrücke mit T3236.55 ausbildet, wird dies durch den Austausch gegen M oder A verhindert. Auch wenn S1795.43 alleine nicht für die hohe konstitutive Aktivität des hH4R verantwortlich ist, trägt diese Aminosäure im Zusammenspiel mit F169ECL2 deutlich zur gleichzeitigen distalen Auswärtsbewegung von TM5 und TM6 bei.
Insgesamt zeigen die Ergebnisse, dass insbesondere F168 und F169 alleine oder F169 im Zusammenspiel mit S179 die Umwandlung des inaktiven in den aktiven Zustand des humanen H4R begünstigen. Die Tatsache, dass sich entsprechende Aminosäuren in äquivalenten Positionen anderer konstitutiv aktiver GPCRs, wie des β2AR oder des H3R befinden, spricht für einen grundlegenden Mechanismus der Rezeptoraktivierung.
Metadata last modified: 26 Nov 2020 00:13
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