| License: Publishing license for publications excluding print on demand (11MB) |
- URN to cite this document:
- urn:nbn:de:bvb:355-epub-323379
- DOI to cite this document:
- 10.5283/epub.32337
| Item type: | Thesis of the University of Regensburg (PhD) |
|---|---|
| Open Access Type: | Primary Publication |
| Date: | 2 August 2016 |
| Referee: | Prof. Dr. Reinhard Sterner |
| Date of exam: | 24 July 2015 |
| Institutions: | Biology, Preclinical Medicine > Institut für Biophysik und physikalische Biochemie > Prof. Dr. Reinhard Sterner |
| Keywords: | tryptophan synthase complex, O-phospho-L-serine, chimera design |
| Dewey Decimal Classification: | 500 Science > 570 Life sciences |
| Status: | Published |
| Refereed: | Yes, this version has been refereed |
| Created at the University of Regensburg: | Yes |
| Item ID: | 32337 |
Abstract (English)
The permanent tryptophan synthase complex (TS) serves as a model system for the investigation of sophisticated protein-protein interactions. The permanent TS consists of a dimer of β-subunits and two α-subunits, which are located at both sites of the dimer, resulting in a αββα arrangement. The α-subunit catalyzes the aldolytic cleavage of indole-3-glycerol-phosphate (IGP). ...
Abstract (English)
The permanent tryptophan synthase complex (TS) serves as a model system for the investigation of sophisticated protein-protein interactions. The permanent TS consists of a dimer of β-subunits and two α-subunits, which are located at both sites of the dimer, resulting in a αββα arrangement. The α-subunit catalyzes the aldolytic cleavage of indole-3-glycerol-phosphate (IGP). Glyceraldehyde-3-phosphate (G3P) is released whereas indole is channeled through a hydrophobic tunnel to the active site of the β-subunit. There, it reacts with L-serine in a PLP-dependent condensation reaction to L-tryptophan and water. The quaternary assembly of the permanent TS enables the bi-directional activation of the subunits within the complex. This ensures the coordination of IGP cleavage and condensation of indole and L-serine to tryptophan.
The effects of complex formation and allosteric communication on the enzymatic parameters of the subunits differ in detail in diverse extant organisms. We were interested in the questions how these differences reflect the evolutionary history and which characteristics a primordial TS might have featured. In order to answer these questions, a phylogenetic tree was constructed using concatenated αβ-sequences. The α- and β-sequences corresponding to the root of this tree are the most probable predecessor of permanent TS in the last common ancestor (LCA). The LCA α- and β-subunits were separately expressed in E. coli. Steady-state kinetics revealed that the LCA α-subunit is comparably active as extant α-subunits whereas the LCA β-subunit has a higher activity compared to extant β-subunits. A strong interaction between the LCA subunits with a Kd in the nanomolar range was detected by fluorescence titration. The formation of a LCA TS with αββα stoichiometry was verified by analytical size exclusion chromatography. Complex formation results in a significant increase of the activity of the α-subunit and a slight decrease of the activity of the β-subunit. The slow rate of tryptophan-release might be the rate-limiting step of the β-subunit in the LCA TS as indicated by stopped-flow experiments. Different accessibilities of isolated and complexed β-subunits indicated that a hydrophobic tunnel between the active sites had already existed in the LCA TS. Mutual adaptation of the subunits, which results in a more efficient catalysis of tryptophan and the specialization as tryptophan synthase, seems to have evolved recently to scope with the elevated need of fast-growing organisms for tryptophan.
The TrpB enzyme family consists of the large group of TrpB1 enzymes (β-subunits of permanent TS) and the smaller group of TrpB2 enzymes. The sequence identity between the groups is less than 30 %, which indicates an early divergent evolution in the TrpB enzyme family. The active site of both groups differs in one position, which is an aspartate in all TrpB1 enzymes and an arginine in all TrpB2 enzymes. Whereas TrpB1 has a specificity for L-serine, TrpB2 uses O-phospho-L-serine (OPS) for the synthesis of tryptophan. The importance of the conserved arginine for the preference of OPS as substrate was validated by structural analysis of a TrpB2 enzyme with bound OPS and mutagenesis studies.
The TrpB2 group is further subdivided into TrpB2i enzymes, which are encoded within the trp operon, and TrpB2a and TrpB2o enzymes, which are encoded outside of the trp operon. It had been previously shown that a transient, ligand-dependent TS with αββ stoichiometry is formed by ssTrpB2i and ssTrpA2 in S. solfataricus. The influence of ssTrpB2i ligands on the stability of the transient TS was investigated. It turned out that the β-substituent of a bound amino acid at the active site of ssTrpB2i does not influence the interaction with ssTrpA2. This indicates that chemical transformations at the β-subunit have no influence on the TS stability. Like in permanent TS, the active sites of the α- and β-subunits seem to be connected by a hydrophobic tunnel. Indications for the existence of the hydrophobic tunnel are: 1) the GP-bound α-subunit prevents the conversion of external indole to tryptophan, 2) only little indole is released during the TS reaction and 3) the main amount of indole formed at the α-subunit is immediately converted to tryptophan by the associated β-subunit. These notions argue for the early divergence in the TS evolution.
The phylogeny of transient TS was investigated by a sequence similarity network (SSN) of the TrpA enzyme family. It revealed that TrpA2 enzymes also exist in organisms like Thermoplasma volcanium, which have only TrpB2a, encoded outside of the trp operon. This indicates that tvTrpA2 and tvTrpB2a form a transient, ligand-dependent TS. This hypothesis was validated by analytical size exclusion chromatography and SPR. A comparison of the structures of the permanent TS from S. typhimurium and the transient TS from S. solfataricus shows that they differ in the quaternary assembly of the subunits. While in the permanent TS three parts of stTrpB1 contribute to the interaction with stTrpA1, only one N-terminal part of ssTrpB2i interacts with ssTrpA2 in the transient TS. The transfer of this N-terminal part of ssTrpB2i or tvTrpB2a is sufficient to convert the non-interacting ssTrpB2a into an enzyme, capable of interacting with and activating an α-subunit (ssTrpA2 or tvTrpA2). This finding illustrates conservation in structure and conformational flexibility present within the family of TrpB2 enzymes.
Translation of the abstract (German)
Der permanente Tryptophansynthase Komplex (TS) dient als Modellsystem zur Untersuchung von hochentwickelten, sich wechselseitig regulierenden Protein-Protein Interaktionen. Der permanente TS besteht aus einem Dimer von β-Untereinheiten und zwei an beiden Seiten des Dimers assoziierten α-Untereinheiten, welche eine αββα-Anordnung ergeben. Die α-Untereinheit katalysiert die aldolytische Spaltung ...
Translation of the abstract (German)
Der permanente Tryptophansynthase Komplex (TS) dient als Modellsystem zur Untersuchung von hochentwickelten, sich wechselseitig regulierenden Protein-Protein Interaktionen. Der permanente TS besteht aus einem Dimer von β-Untereinheiten und zwei an beiden Seiten des Dimers assoziierten α-Untereinheiten, welche eine αββα-Anordnung ergeben. Die α-Untereinheit katalysiert die aldolytische Spaltung von Indol-3-glycerolphosphat (IGP). Während das bei dieser Reaktion entstandene Glycerinaldehyd-3-phosphat (G3P) aus dem Komplex diffundiert, gelangt Indol durch einen hydrophoben Tunnel innerhalb des Komplexes zum aktiven Zentrum der assoziierten β-Untereinheit. Dort wird es mit L-Serin in einer PLP-abhängigen Kondensationsreaktion zu Tryptophan umgesetzt. Die Anordnung der Untereinheiten erlaubt neben der Ausbildung eines hydrophoben Tunnels die wechselseitige Regulation der Aktivitäten beider Untereinheiten. Hierdurch wird gewährleistet, dass die Bildung von Indol und dessen Umsetzung zu Tryptophan miteinander verknüpft sind.
Die Auswirkungen von Komplexbildung und allosterischer Kommunikation auf die enzymatischen Parameter unterscheiden sich im Detail bei den Untereinheiten aus verschiedenen rezenten Organismen. Daher stellt sich die Frage, welche Charakteristika ein ursprünglicher TS hatte und welche Merkmale erst im Laufe der Artenentwicklung entstanden. Zur Beantwortung dieser Frage wurde ein Stammbaum ausgehend von konkatenierten αβ-Sequenzen erstellt. Die der Wurzel des Stammbaums entsprechenden α- und β-Sequenzen stellen den mutmaßlichen TS im letzten gemeinsamen Vorfahren der Bakterien (LCA) dar und können somit als Ursprungspunkt in der Evolution des permanenten TS angesehen werden. Die entsprechenden LCA α- und β-Untereinheiten ließen sich separat löslich in E. coli exprimieren. Steady-state Kinetiken zeigten, dass die monomere LCA α-Untereinheit eine mit rezenten α-Untereinheiten vergleichbare Aktivität hat und die dimere β-Untereinheit eine im Vergleich zu rezenten β-Untereinheiten erhöhte Aktivität aufweist. Durch Gelfiltrationsexperimente und Fluoreszenztitrationen wurde eine starke Interaktion zwischen den Untereinheiten unter Bildung eines LCA TS mit αββα-Stöchiometrie nachgewiesen. Die Komplexbildung führt zur deutlichen Erhöhung der katalytischen Effizienz der LCA α-Untereinheit und zu einer leichten Verringerung der Aktivität der LCA β-Untereinheit. Pre-steady-state Kinetiken deuten darauf hin, dass die Aktivität der β-Untereinheit im LCA TS durch eine verlangsamte Tryptophan-Freisetzung limitiert sein könnte. Die unterschiedliche Zugänglichkeit von freier bzw. komplexierter LCA β-Untereinheit für ein großes Nukleophil zeigte, dass die aktiven Zentren im LCA TS genau wie in rezenten TS durch einen Tunnel verbunden sind. Eine wechselseitige Anpassung der Untereinheiten mit einer daraus resultierenden Erhöhung der katalytischen Effizienz der Gesamtreaktion sowie eine Spezialisierung auf die alleinige Funktion als Tryptophansynthase erfolgte wahrscheinlich erst zu einem späteren Zeitpunkt in der TS Evolution. Möglicherweise wurde diese Entwicklung getrieben vom großen Bedarf an Tryptophan in schnell wachsenden Organismen.
Die TrpB Enzymfamilie besteht aus der großen Gruppe der TrpB1 Enzyme (β Untereinheiten der permanenten TS) und aus der kleineren Gruppe der TrpB2 Enzyme. Eine Sequenzidentität von unter 30 % zwischen TrpB1 und TrpB2 deutet auf eine frühe divergente Evolution in der TrpB Enzymfamilie hin. In den aktiven Zentren ist an einer bestimmten Position bei TrpB1 ein Aspartat und bei allen TrpB2 ein Arginin konserviert. Durch HPLC Analysen konnte O-Phospho-L-Serin (OPS) als Substrat von TrpB2 Enzymen identifiziert werden. Die Strukturanalyse eines TrpB2 Enzyms mit gebundenem OPS verdeutlicht die Koordination der Phosphatgruppe durch das konservierte Arginin. Die Substratspezifität-determinierende Rolle dieses Restes wurde durch Mutationsanalysen bestätigt. Somit konnte TrpB2 die Funktion der OPS abhängigen Tryptophansynthase zugeordnet werden.
Die TrpB2 Gruppe ist unterteilt in TrpB2i Enzyme, welche innerhalb des trp Operon kodiert werden, und TrpB2a und TrpB2o Enzyme, welche außerhalb des trp Operons kodiert werden. Für ssTrpB2i aus S. solfataricus konnte vorangehend gezeigt werden, dass es mit der α-Untereinheit dieses Organismus (ssTrpA2) einen transienten, ligandenabhängigen TS mit αββ-Stöchiometrie bildet. Die Abhängigkeit der Interaktion von ssTrpB2i Liganden wurde in der vorliegenden Arbeit eingehend untersucht. Dabei stellte sich heraus, dass der β-Substituent der gebundenen Aminosäure keinen Einfluss auf die Interaktion mit ssTrpA2 hat. Dies deutet darauf hin, dass der Komplex während der gesamten Katalyse mit den dabei stattfindenden Änderungen am β-Substituenten der gebundenen Aminosäure bestehen bleibt. Wie bei permanenten TS sind wahrscheinlich auch bei transienten TS die aktiven Zentren der α- und β-Untereinheiten miteinander verbunden, da 1) die Reaktion von externem Indol zu Tryptophan durch die GP-gebundene α-Untereinheit behindert wird, 2) nahezu kein Indol aus dem Komplex entweicht und 3) der Großteil von dem an der α-Untereinheit gebildeten Indol an der assoziierten β-Untereinheit zu Tryptophan umgesetzt wird. Dies lässt vermuten, dass es sich bei transienten TS und permanenten TS um die Produkte einer divergenten Evolution handelt.
Um die Gesamtheit von in der Natur vorkommenden transienten TS zu identifizieren, wurde eine phylogenetische Analyse der TrpA Enzymfamilie unternommen. Hier zeigte sich, dass ssTrpA2 Teil einer größeren Untergruppe ist. Diese beinhaltet auch TrpA2 Enzyme, welche in Organismen wie Thermoplasma volcanium vorkommen, die nur das außerhalb des trp Operons kodierte TrpB2a Enzym besitzen. Dies legt nahe, dass tvTrpA2 und tvTrpB2a einen transienten, ligandenabhängigen Komplex bilden. Diese Vermutung konnte durch Gelfiltration und SPR bestätigt werden. Der Vergleich der Kristallstrukturen des transienten TS aus S. solfataricus und des permanenten TS aus S. typhimurium zeigt, dass diese sich in ihrer Quartärstruktur unterscheiden. Während im Fall des permanenten TS drei Bereiche von stTrpB1 die Interaktionsfläche bilden, ist beim transienten TS nur ein N-terminaler Bereich von ssTrpB2i in direktem Kontakt mit der entsprechenden α-Untereinheit. Die Übertragung dieses Bereichs aus ssTrpB2i oder tvTrpB2a ist ausreichend, um aus dem nicht-interagierenden ssTrpB2a Enzym die β-Untereinheit eines transienten TS zu machen, welche die assoziierte α-Untereinheit (ssTrpA2 bzw. tvTrpA2) aktiviert. Dies verdeutlicht die Konserviertheit in der Struktur und in der konformationellen Flexibilität innerhalb der Gruppe der TrpB2 Enzyme.
Metadata last modified: 25 Nov 2020 23:41
Owner only: item control page
Download Statistics