| License: Publishing license for publications excluding print on demand (2MB) |
- URN to cite this document:
- urn:nbn:de:bvb:355-epub-326381
- DOI to cite this document:
- 10.5283/epub.32638
| Item type: | Thesis of the University of Regensburg (PhD) |
|---|---|
| Date: | 23 October 2015 |
| Referee: | Prof. Dr. Peter Oefner and Prof. Dr. Frank-Michael Matysik |
| Date of exam: | 19 October 2015 |
| Institutions: | Medicine > Institut für Funktionelle Genomik > Lehrstuhl für Funktionelle Genomik (Prof. Oefner) Chemistry and Pharmacy > Institut für Analytische Chemie, Chemo- und Biosensorik > Instrumentelle Analytik (Prof. Frank-Michael Matysik) |
| Keywords: | Gas chromatography/ atmospheric pressure chemical ionization time-of-flight mass spectrometry, GC-APCI-TOFMS, gas chromatograhy, atmospheric pressure chemical ionization, mass spectrometry, metabolite identification, metabolomics, ionization efficiency, D-2-hydroxyglutarate |
| Dewey Decimal Classification: | 500 Science > 540 Chemistry & allied sciences |
| Status: | Published |
| Refereed: | Yes, this version has been refereed |
| Created at the University of Regensburg: | Yes |
| Item ID: | 32638 |
Abstract (English)
With the commercial introduction of atmospheric pressure chemical ionization for gas chromatography in 2008, GC-APCI coupled to high-resolution time-of-flight mass spectrometry (GC-APCI-HRTOFMS) became an interesting addition to the metabolomics toolbox. APCI is a soft ionization technique and its application to hyphenate GC to high resolution MS opens up promising new means for the ...
Abstract (English)
With the commercial introduction of atmospheric pressure chemical ionization for gas chromatography in 2008, GC-APCI coupled to high-resolution time-of-flight mass spectrometry (GC-APCI-HRTOFMS) became an interesting addition to the metabolomics toolbox. APCI is a soft ionization technique and its application to hyphenate GC to high resolution MS opens up promising new means for the identification of unknown signals in complex matrices. The actual utility of GC-APCI-HRTOFMS in metabolic fingerprinting and profiling applications to biological matrices is the topic of this doctoral thesis.
During comparison of GC-APCI-HRTOFMS with GC×GC-EI-TOFMS, GC-EI-TOFMS, GC-CI-qMS, and GC-EI-qMS in my master thesis, it was noticed that reproducibility of APCI was affected greatly by differences in humidity in the laboratory. Therefore, the impact of humidity in the APCI source on ionization efficiency and repeatability was systematically studied in the initial project of this doctoral thesis. Water was continuously infused to ensure a constant humidity during APCI in the analysis of methylchloroformate (MCF)- and methoxime-trimethylsilyl (MeOx-TMS) derivatized metabolites. These two different derivatization strategies are most commonly pursued in GC-MS based metabolome analyses. Several infusion rates were tested and a rate of 0.4 mL/h yielded an average 16.6-fold increase in intensity of the protonated molecules ([M+H]+) of 20 MCF-derivatized metabolites through suppression of in-source fragmentation. Water infusion, however, did not improve efficiency and repeatability of APCI of methoxime-trimethylsilyl (MeOx-TMS) derivatives of metabolite standards. Then, the impact of water infusion on metabolic fingerprinting of biological specimens was investigated. Water infusion led to a marked increase in the number of metabolites identified in MCF-derivatized cancer cell extracts via their [M+H]+ ions and improved repeatability of peak areas, almost doubling the number (N=23) of identified, significantly regulated metabolites (false discovery rate <0.05) between controls and cancer cells treated with the heat-shock protein 90 (Hsp90) inhibitor 17-DMAG.
Next, matrix effects caused by co-eluting compounds were investigated that might influence ionization. Strikingly, recovery of three out of seven internal standards used in a spike-in experiment was below 75% in one or several of the three biological matrices tested, namely Escherichia coli extract, serum, and urine. This was due to suppression by their respective endogenous metabolite that was present at a high concentration. Ion suppression caused by a co-eluting compound was further shown for three pairs of co-eluting standards employing standard mixtures with increasing concentrations of the co-eluting compounds. Overall these experiments demonstrated that matrix effects have to be taken into consideration in GC-APCI-MS.
In the course of my doctoral thesis, Bruker Daltonics (Bremen, Germany) introduced a redesigned APCI source. To test the capabilities of this source, MeOx-TMS derivatized supernatants of untreated cancer cells were analyzed by GC-APCI-HRTOFMS using both the original APCI I and the redesigned APCI II source. The latter source almost doubled the number of spectral features with signal-to-noise ratios greater than 20 that could be extracted from metabolite fingerprints and increased the absolute number of identified metabolites by 33% from 36 to 48. In addition, the median area RSDs of extracted features decreased from 33% to 24%. These improvements further resulted in a more than fourfold median decrease in lower limits of quantification to 0.002 - 3.91 µM as evidenced for 20 MeOx-TMS derivatized metabolite standards and a concomitant increase in the linear range by 0.5 to almost three orders of magnitude.
Finally, GC-APCI(II)-HRTOFMS was applied to the enantioselective quantitative profil-ing of the oncometabolite D-2-hydroxyglutarate (D-2-HG). MCF derivatization and GC analysis on a chiral gamma-cyclodextrin (Rt-rDEXsa) column were used to separate the D from the L enantiomer of 2-HG. Separation was optimized to avoid co-elution of D-2-HG with a highly abundant matrix compound present in cell culture media supplemented with bovine serum albumin. The use of APCI-HRTOFMS yielded highly specific quantifier ions and the infusion of water enhanced lower limits of quantification and repeatability by factors of ten and two, respectively. Analysis of a racemic 2-HG standard after MCF derivatization yielded a total of four peaks instead of the expected two signals for the D- and L-enantiomer. It was then shown that in addition to an open-chain three-fold derivative of 2-HG the methyl ester of the D/L-2-HG lactone is formed during derivatization. Since lactone of D/L-2-HG was found to be naturally present in biological specimens, the developed method was eventually based on the open-chain three-fold derivative of 2-HG yielding LLOQ values of 0.49 µM (D-2-HG) and 0.24 µM (L-2-HG). The GC-APCI(II)-HRTOFMS approach was successfully applied to the determination of D/L-2-HG concentration levels in urine specimens of 23 acute myeloid leukemia (AML) patients and 6 healthy controls, which were validated by HPLC-MS/MS. The yet to be discovered source of 2-HG lactone in sera of AML patients carrying neomorphic isocitrate dehydrogenase mutations promises to shed new light on the pathogenesis and progression of AML.
In summary this doctoral thesis demonstrates that GC-APCI-HRTOFMS is a useful addition to the established GC-MS approaches in metabolomics. Studies on factors potentially influencing the ionization, namely water infusion, matrix effects and source type, distinctly widened the applicability of GC-APCI-HRTOFMS for qualitative and quantitative analysis of MeOx-TMS and MCF derivatized metabolites. The ability of APCI along with water infusion to efficiently ionize a broad range of MCF metabolites was proven and in the following applied to comparative metabolic fingerprinting in extracts of treated cancer cells. Finally, the outstanding quantitative capabilities of GC-APCI(II)-HRTOFMS were used in a first enantioselective profiling application for quantitative determination of the oncometabolite D-2-HG. Altogether, this doctoral thesis contributed significantly to the excellent progress GC-APCI-MS has made towards becoming a routine tool in metabolomics.
Translation of the abstract (German)
Mit der kommerziellen Einführung der chemischen Ionisation bei Atmosphärendruck für die Gaschromatographie im Jahr 2008 wurde GC-APCI in Kombination mit hochauflösender Massenspektrometrie (GC-APCI-HRTOFMS) als zusätzliches Verfahren für das Methodenspektrum in der Metabolomik interessant. Bei der APCI handelt es sich um eine weiche Ionisationstechnik. In Kombination mit GC und hochauflösender MS ...
Translation of the abstract (German)
Mit der kommerziellen Einführung der chemischen Ionisation bei Atmosphärendruck für die Gaschromatographie im Jahr 2008 wurde GC-APCI in Kombination mit hochauflösender Massenspektrometrie (GC-APCI-HRTOFMS) als zusätzliches Verfahren für das Methodenspektrum in der Metabolomik interessant. Bei der APCI handelt es sich um eine weiche Ionisationstechnik. In Kombination mit GC und hochauflösender MS eröffnet APCI neue erfolgversprechende Möglichkeiten zur Identifizierung von unbekannten Signalen in komplexen Matrices. Diese Doktorarbeit behandelt die Frage, inwiefern GC-APCI-HRTOFMS in „Metabolic Fingerprinting“ und „Metabolic Profiling“-Untersuchungen in biologischen Matrices nützlich ist.
Im Laufe des Vergleichs von GC-APCI-HRTOFMS mit GC×GC-EI-TOFMS, GC-EI-TOFMS, GC-CI-qMS und GC-EI-qMS wurde festgestellt, dass sich Schwankungen in der Luftfeuchtigkeit im Labor sehr stark auf die Reproduzierbarkeit der APCI auswirkten. Deshalb wurde im anfänglichen Projekt dieser Doktorarbeit systematisch untersucht, ob die Feuchtigkeit in der APCI-Quelle die Ausbeute und Wiederholbarkeit der Ionisierung beeinflusst. Die Zugabe von Wasser erfolgte kontinuierlich während der Analyse von mittels Chlorameisensäuremethylester (MCF)/MeOH und sequenzieller Methoximierung/Silylierung derivatisierten Metaboliten, um einen konstanten Feuchtigkeitsgehalt bei der APCI zu gewährleisten. Diese beiden unterschiedlichen Derivatisierungsstrategien werden in Metabolomics-Untersuchungen mittels GC-MS am häufigsten gebraucht. Verschiedene Infusionsraten von Wasser wurden getestet. Durch Zugabe von 0.4 mL Wasser pro Stunde konnten die Intensitäten der protonierten Moleküle ([M+H]+) der verwendeten 20 MCF derivatisierten Metabolitenstandards durchschnittlich um das 16.6-fache erhöht werden. Dies wurde aufgrund der resultierenden geringeren Fragmentierung in der APCI Quelle erreicht. Die Zugabe von Wasser führte hingegen im Fall von mittels sequenzieller Methoximierung/Silylierung (MeOx-TMS) derivatisierten Metabolitenstandards zu keiner Verbesserung bezüglich Ausbeute und Wiederholbarkeit der APCI. Anschließend wurde überprüft, inwiefern sich die Zugabe von Wasser bei der Untersuchung von biologischen Proben mittels „Metabolic Fingerprinting“ auswirkt. Die Zugabe von Wasser erhöhte dabei die Anzahl der über das jeweilige protonierte Molekül identifizierten Metabolite in MCF-derivatisierten Extrakten von Krebszellen deutlich und verbesserte die Wiederholpräzision der Peakflächen, was die Zahl der identifizierten und signifikant regulierten Metabolite (False Discovery Rate <0.05) zwischen Kontrollen und den mit dem Hitzeschockprotein 90 (Hsp90) Inhibitor 17-DMAG behandelten Krebszellen auf insgesamt 23 fast verdoppelt hat.
Des Weiteren wurden mögliche Ionisierungseffekte aufgrund von ko-eluierenden Matrixbestandteilen untersucht. Insbesondere lag die Wiederfindungsrate von drei der sieben verwendeten internen Standards im Spike-in Experiment unterhalb von 75% in einer oder mehreren der drei untersuchten biologischen Matrices (Escherichia coli Extrakt, Serum und Urin). Dies war auf Ionensuppression durch den jeweiligen endogenen Metaboliten zurückzuführen, der hochkonzentriert vorlag. Durch eine ko-eluierende Standardverbindung hervorgerufene Ionisierungseffekte konnten ferner experimentell für drei solcher Paare aufgezeigt werden. Dabei wurden die mit den Analyten ko-eluierenden Standardverbindungen in steigenden Konzentrationen eingesetzt. Insgesamt hat sich in allen Experimenten zu Matrixeffekten herausgestellt, dass diese in der GC-APCI-MS berücksichtigt werden müssen.
Im Verlauf meiner Doktorarbeit wurde eine neu entworfene APCI-Quelle von Bruker Daltonics (Bremen, Deutschland) vorgestellt. Um die Leistungsfähigkeit dieser Quelle zu überprüfen wurden MeOx-TMS derivatisierte Zellkulturüberstände unbehandelter Krebszellen mittels GC-APCI-HRTOFMS analysiert. Dies erfolgte sowohl unter Verwendung der ursprünglichen APCI I Quelle als auch der neu entworfenen APCI II Quelle. Letztere Quelle konnte die Zahl der aus den metabolischen Fingerabdrücken gewonnenen Signale mit Signal-zu-Rausch-Verhältnis >20 fast verdoppeln. Darüber hinaus gelang es, die absolute Anzahl identifizierter Metabolite in diesen Proben um 33% von 36 auf 48 zu steigern und die mediane relative Standardabweichung der Peakflächen obiger gewonnener Signale von 33% auf 24% zu verringern. Außerdem war es unter Verwendung der verbesserten APCI II Quelle möglich, die mediane untere Quantifizierungsgrenze für 20 MeOx-TMS derivatisierte Metabolitenstandards um mehr als das Vierfache auf 0.002-3.91 µM zu erniedrigen und gleichzeitig den linearen Bereich um eine halbe Größenordnung auf insgesamt drei Konzentrationsgrößenordnungen zu erhöhen.
Schließlich wurde GC-APCI(II)-HRTOFMS zur enantioselektiven, quantitativen Bestimmung des Onko-Metaboliten D-2-Hydroxyglutarat (D-2-HG) verwendet. MCF Derivatisierung mit nachfolgender gaschromatographischer Analyse mittels einer chiralen gamma-Cyclodextrin (Rt-rDEXsa) Kapillarsäule wurden eingesetzt, um das D- vom L-Enantiomer des 2-HGs abzutrennen. Die Trennung wurde optimiert, um die Koelution von D-2-HG und einer hochabundanten Matrixkomponente in Zellkulturmedien mit zugegebenem Rinderserumalbumin zu vermeiden. APCI und TOFMS ergaben Ionen von hoher Spezifität für die Quantifizierung. Die Zugabe von Wasser verbesserte die unteren Quantifizierungsgrenzen und die Reproduzierbarkeit der Methode um das Zehn- bzw. Zweifache. Bei der Analyse eines racemischen 2-HG Standards nach MCF Derivatisierung konnten anders als vermutet insgesamt vier statt zwei Signale für das D- und L-Enantiomer detektiert werden. Daraufhin wurde gezeigt, dass zusätzlich zum offenkettigen Dreifachderivat der Methylester des Lactons von 2-HG während der Derivatisierung gebildet wird. Dadurch, dass das fünfgliedrige Lacton von D/L-2-HG natürlich in biologischen Proben vorkommt, wurde in der entwickelten Methode schließlich das offenkettige Dreifachderivat von 2-HG zur Quantifizierung herangezogen. Daraus resultierten untere Quantifizierungsgrenzen von 0.49 µM (D-2-HG) und 0.24 µM (L-2-HG). GC-APCI(II)-HRTOFMS konnte erfolgreich zur Bestimmung von D/L-2-HG Spiegeln in Urinproben von 23 Patienten mit akuter myeloischer Leukämie (AML) und 6 gesunden Probanden angewandt und die erzielten Ergebnisse mittels HPLC-MS/MS validiert werden. Die Aufklärung des Ursprungs des 2-HG-Lactons in Serumproben von AML Patienten mit mutierter Isocitrat-Dehydrogenase verspricht neue Einblicke in Entstehen und Fortschreiten von AML zu geben.
Zusammengefasst konnte in dieser Doktorarbeit aufgezeigt werden, dass GC-APCI-HRTOFMS ein nützliches zusätzliches Verfahren zu den etablierten GC-MS Methoden in der Metabolomik ist. Studien zu Faktoren, welche die Ionisierung möglicherweise beeinflussen – nämlich die Zugabe von Wasser, Matrixeffekte und Quellentyp – konnten die Anwendbarkeit von GC-APCI-HRTOFMS für die qualitative und quantitative Analyse von MeOx-TMS und MCF derivatisierten Metaboliten erheblich steigern. Dabei konnte nachgewiesen werden, dass mittels APCI und Wasserzugabe eine große Bandbreite an MCF derivatisierten Metaboliten ionisiert werden kann. Dies wurde nachfolgend bei der vergleichenden Analyse metabolischer Fingerabdrücke von Extrakten behandelter Krebszellen angewandt. Schlussendlich wurde die ausgezeichnete quantitative Leistungsfähigkeit von GC-APCI(II)-HRTOFMS in einer ersten enantioselektiven „Metabolic Profiling“-Anwendung für die Quantifizierung des Onko-Metaboliten D-2-HG genutzt. Summa summarum hat diese Doktorarbeit einen wichtigen Beitrag zur zukünftigen, routinemäßigen Anwendung der GC-APCI-MS in der Metabolomik geleistet.
Metadata last modified: 25 Nov 2020 23:29
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