| License: Publishing license for publications including print on demand PDF - Published Version (2MB) |
- URN to cite this document:
- urn:nbn:de:bvb:355-epub-331223
- DOI to cite this document:
- 10.5283/epub.33122
| Item type: | Thesis of the University of Regensburg (PhD) |
|---|---|
| Open Access Type: | Primary Publication |
| Date: | 14 January 2016 |
| Referee: | Prof. Dr. Frank-Michael Matysik |
| Date of exam: | 18 December 2015 |
| Institutions: | Medicine > Institut für Funktionelle Genomik > Lehrstuhl für Funktionelle Genomik (Prof. Oefner) |
| Keywords: | metabolomics, enantiomers, gas chromatography-mass spectrometry, non-alcoholic fatty liver disease, chiralomics. Metabolomik, Enantiomere, Gaschromatographie-Massenspektrometrie, Nichtalkoholische Fettleber, Chiralomik |
| Dewey Decimal Classification: | 500 Science > 500 Natural sciences & mathematics 500 Science > 540 Chemistry & allied sciences 600 Technology > 610 Medical sciences Medicine |
| Status: | Published |
| Refereed: | Yes, this version has been refereed |
| Created at the University of Regensburg: | Yes |
| Item ID: | 33122 |
Abstract (English)
Chirality is not a rare phenomenon in metabolomes. Nevertheless, common metabolomics approaches still detect enantiomers as a single signal. However, they are individual metabolites due to different stereospecific enzymes catalyzing their metabolism. The here presented methods consider the configuration of chiral metabolites in the interpretation of metabolomics data to investigate the following ...
Abstract (English)
Chirality is not a rare phenomenon in metabolomes. Nevertheless, common metabolomics approaches still detect enantiomers as a single signal. However, they are individual metabolites due to different stereospecific enzymes catalyzing their metabolism. The here presented methods consider the configuration of chiral metabolites in the interpretation of metabolomics data to investigate the following biomedical hypotheses. D-Amino acids (D-AAs), albeit much lower abundant than their antipodes, are potential diagnostic markers for diseases affecting the liver, the gut and the gut flora. The other assumption of this thesis was that the comprehensive resolution of stereoisomers from metabolomes, providing more detailed metabolic fingerprints than conventional approaches, would facilitate the differentiation of groups.
In order to investigate the former hypothesis two different GC-MS techniques were used for the implementation, optimization and validation of quantitative AAE analysis, primarily in urine and serum. The GC-qMS method using MeOH/Methylchloroformate (MCF) derivatization and a gamma-CD derivative for enantiomer separation was chosen, among several tested derivative/chiral selector combinations, in my diploma thesis as the most effective GC-qMS method for quantitative amino acid enantiomer (AAE) analysis with respect to the number of baseline separated proteinogenic AAE pairs and peak intensities. Sample preparation was optimized to allow the accurate quantification of exclusively free AAEs. In addition injection parameter and IS contents were optimized to decrease LLOQs and the method was validated by comparison to a non-chiral GC-qMS method for AA quantification. Finally, the method was subjected to biomedical applications that underlined the potential of D-AAs as diagnostic markers due to changed D-AA levels found in mouse serum and mouse liver tissues as a consequence of pathological changes of the liver. The method separated ten pairs of AAEs, but it failed to separate Phe enantiomers, D-Ile/L-Leu, L-Thr/L-Asp, and L-Ser/D-Met. For L-Thr, L-Asp and D-Met a specific m/z enabled their accurate quantification in SIM mode but the quantification of the other coeluting enantiomers was impeded. Moreover, not each D-AA that was baseline separated from its antipode could be quantified in all samples of interest due to insufficient LLOQs. Thus, the potential of comprehensive GC×GC-TOFMS was tested for quantitative AAE analysis in urine and serum. The same derivative/chiral selector combination was used and a ZB-AAA column provided best AAE resolution as the second dimension selector from two different selectors tested. Upon optimization of the temperature program, baseline separation was accomplished for all detected AAEs except for Phe enantiomers. The method was validated by comparison to the chiral GC-qMS method and pros and cons of both approaches were discussed. The application of chiral GC×GC-TOFMS revealed increased D-AA serum levels in patients with liver cirrhosis when compared to respective serum levels of healthy individuals. Finally, performing a chiral fingerprinting approach, it was demonstrated that comprehensive enantiomer resolution assisted with the differentiation of different NAFLD stages in the analysis of urine samples from respective mouse models. There was observed a clear group separation of the three investigated groups after PCA of differentiating features and D-Val, D-2-Hydroxyglutaric acid and D-allo-Ile levels significantly differentiated NASH from hepatic steatosis. There were identified further enantiomers of hydroxydiacids and AA derivatives that significantly differentiated the diseased groups from controls and besides D-Val six other separated AAEs differentiated the experimental groups. This chiral GC-qMS based fingerprinting approach introduced a new field of investigation that I named ‘chiralomics’ as it expanded metabolomics to the chiral dimension.
Translation of the abstract (German)
Viele Stoffwechselprodukte sind chiral, werden aber in der Metabolomik meist nicht getrennt bestimmt. Stereoisomere sind jedoch auf Grund der Stereospezifizität der meisten Enzyme, die für ihren Auf- und Abbau verantwortlich sind, eigenständige Stoffwechselprodukte und Veränderungen in ihrer Abundanz können Aufschluss über gestörte Stoffwechselwege geben. So sind D-Aminosäuren (D-As), die zwar in ...
Translation of the abstract (German)
Viele Stoffwechselprodukte sind chiral, werden aber in der Metabolomik meist nicht getrennt bestimmt. Stereoisomere sind jedoch auf Grund der Stereospezifizität der meisten Enzyme, die für ihren Auf- und Abbau verantwortlich sind, eigenständige Stoffwechselprodukte und Veränderungen in ihrer Abundanz können Aufschluss über gestörte Stoffwechselwege geben. So sind D-Aminosäuren (D-As), die zwar in deutlich geringeren Mengen vorkommen als ihre Spiegelbilder, potenzielle diagnostische Marker für Krankheiten, die beispielsweise die Funktion der Leber, des Darms und der Darmflora beeinträchtigen. Die zweite Annahme der Arbeit war, dass die Auflösung von allen erfassbaren Stereoisomeren, detailliertere metabolische Fingerabdrücke generiert, die die Differenzierung von Gruppen erleichtern.
Initiales Ziel der Dissertation war die Optimierung der GC-MS basierten, quantitativen Analysen von Aminosäure-Enantiomeren in biologischen Proben wie Blut und Urin. Ausgangspunkt war die Derivatisierung der Aminosäuren mit Methylchloroformat und Methanol, gefolgt von deren Trennung auf einer gamma-CD basierten stationären Phase und anschließender Detektion mittels Quadrupol-Massenspektrometrie. Diese Kombination hatte sich im Rahmen meiner Diplomarbeit als die effektivste unter den getesteten Derivat/ Säule Kombinationen für die quantitative Bestimmung von Aminosäure-Enantiomeren erwiesen. Durchgeführte Verbesserungen betrafen die Probenvorbereitung (Vorabtrennung von Proteinen und Durchführung der Derivatisierung ohne Einsatz von NaOH, um die Bestimmung von protein- und peptidgebundenen AsE zu unterbinden), die Injektion und die Konzentration der internen Standards, wodurch eine bis zu 16-fache Verbesserung der unteren Bestimmungsgrenzen erzielt werden konnten. Die optimierte Methode wurde über einen Methodenvergleich mit einer etablierten achiralen GC-qMS Methode für quantitative As Analytik in Serum und Urin validiert. Die Methode ermöglichte die Trennung von zehn Aminosäure-Enantiomerenpaaren, schaffte es jedoch nicht Phe Enantiomere, sowie D-Ile/L-Leu, L-Thr/L-Asp, und L-Ser/D-Met aufzulösen. Von diesen konnten im SIM-Modus, anhand von charakteristischen m/z Werten L-Thr, L-Asp und D-Met quantifiziert werden, während die Bestimmung der anderen überlappenden Enantiomere gestört war. In der Anwendung an Serum und Leberproben aus Mausmodellen zur Fettleber erwiesen sich überdies die Bestimmungsgrenzen ungenügend, um alle D-As, die von ihrer L-Form getrennt waren, in allen Proben zu quantifizieren. Deshalb wurde die Leistungsfähigkeit der allumfassenden zweidimensionalen Gaschromatographie (GC×GC-TOFMS) für die Bestimmung von AsE in Urin und Serum getestet. Es wurde die gleiche As Derivat/chirale Säule Kombination verwendet und zudem eine ZB-AAA Säule, welche die beste Enantiomerenauflösung, von den zwei für die zweite Dimension getesteten Säulen, ermöglichte. Über die Optimierung des Temperaturprograms erreichte ich die Basislinien-Trennung aller erfassten AsE mit Ausnahme der Phe Enantiomere. Die Methode wurde über einen Methodenvergleich mit der chiralen GC-qMS validiert und Vor- und Nachteile beider Methoden wurden diskutiert. Die GC×GC Methode fand erhöhte D-As Serum Gehalte in Leberzirrhose Patienten im Vergleich zum D-As Serum Gehalt in gesunden Probanden und bekräftigte damit die untersuchte Hypothese. Die zweite Annahme dieser Arbeit wurde mit Hilfe eines erstmalig durchgeführten chiralen Fingerprintings untersucht. Es wurde gezeigt, dass die allgemeine Trennung von Enantiomeren zur Unterscheidung verschiedener Stufen der Nichtalkoholischen Fettleber, anhand von Urin der entsprechenden Mausmodelle, beiträgt. Eine deutliche Gruppentrennung war mit Hilfe von Hauptkomponentenanalyse der differenzierenden Peaks sichtbar und D-Val, D-allo-Ile und D-2-Hydroxyglutarat Gehalte unterschieden die Steatohepatitis von der hepatischen Steatose deutlich. Es wurden weitere Enantiomere von Hydroxydisäuren und As Derivaten identifiziert, die die kranken von den gesunden Mäusen unterschieden und weitere sechs As Enantiomere differenzierten die experimentellen Gruppen. Dieser allumfassende enantioselektive Ansatz mittels GC-qMS eröffnete ein neues Wissenschaftsgebiet, welches ich „Chiralomics“ nannte, da es das Gebiet der „Metabolomics“ um die chirale Dimension erweitert.
Metadata last modified: 25 Nov 2020 23:14
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