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- URN zum Zitieren dieses Dokuments:
- urn:nbn:de:bvb:355-epub-332547
- DOI zum Zitieren dieses Dokuments:
- 10.5283/epub.33254
| Dokumentenart: | Hochschulschrift der Universität Regensburg (Dissertation) |
|---|---|
| Open Access Art: | Primärpublikation |
| Datum: | 2 Februar 2017 |
| Begutachter (Erstgutachter): | Prof. Dr. Antje J. Bäumner und PD Dr. Hans-Heiner Gorris und Prof. Dr. Achim Göpferich |
| Tag der Prüfung: | 29 Januar 2016 |
| Institutionen: | Chemie und Pharmazie > Institut für Analytische Chemie, Chemo- und Biosensorik |
| Stichwörter / Keywords: | upconverting nanoparticles, surface modification, luminescence imaging, click chemistry |
| Dewey-Dezimal-Klassifikation: | 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 540 Chemie |
| Status: | Veröffentlicht |
| Begutachtet: | Ja, diese Version wurde begutachtet |
| An der Universität Regensburg entstanden: | Ja |
| Dokumenten-ID: | 33254 |
Zusammenfassung (Englisch)
The surface modification of upconverting nanoparticles was a main focus of this thesis and a wide variety of different functionalities were introduced on the nanoparticle surface in the process. The growth of a silica shell with a preferably simultaneous silanization proved to be a convenient way to create both a hydrophilic surface crucial for bioanalytical applications and an accessible ...
Zusammenfassung (Englisch)
The surface modification of upconverting nanoparticles was a main focus of this thesis and a wide variety of different functionalities were introduced on the nanoparticle surface in the process. The growth of a silica shell with a preferably simultaneous silanization proved to be a convenient way to create both a hydrophilic surface crucial for bioanalytical applications and an accessible functionality for subsequent modification. The utilization of silanol, amine, carboxyl, or phosphonate groups yielded UCNPs with strongly differing stabilities in dispersion and surface charges. A strong aggregation was observed for both an amine modification and the non-modified silanol groups of a pure silica shell with a tendency enhancement for a reduced shell thickness. Furthermore, surface phosphonate groups led to the formation of aggregates with high uniformity in both size and shape. In contrast, an optimized modification process to introduce carboxylic acids on the surface yielded monodisperse UCNPs with a diameter of 13 nm that are efficiently stabilized in aqueous dispersion. The presence of these predominantly single nanoparticles in high abundance was confirmed both by dynamic light scattering and transmission electron microscopy studies. This high monodispersity was also realizable by a ligand exchange utilizing the polymer polyacrylic acid. The method applied relied on a prior exchange of the hydrophobic oleic acid with BF4- ions allowing a subsequent modification with the polymer with simplified process conditions and reduced expenditure of time.
Furthermore, the copper-catalyzed azide-alkyne cycloaddition (CuAAC) was studied as a potential beneficial coupling reaction since it merged the advantages of the "Click chemistry" and "bioorthogonal reactions" concept. The associated alkyne and azide groups were bound to the nanoparticle surface by silanization of silica-coated UCNPs and the nanoparticles differed drastically in their dispersion stability. While an azide-functionalized surface exerted a certain degree of stabilization, alkyne functionalities led to a strong nanoparticle aggregation and precipitation in a very short time. However, both functional groups allowed an efficient and highly specific binding of their respective counterpart shown by an exemplary Click reaction with a fluorophore and also the important role of the copper(I) catalyst was demonstrated. The attachment of more complex molecules including biochemical functionalities or additionally stabilizing moieties revealed a good feasibility of a modification by the copper-catalyzed azide-alkyne cycloaddition. A simultaneous modification of the UCNPs with azide and carboxyl groups led to an enhanced nanoparticle stability compared to a pure azide functionalization.
Studies about the creation of a biomimetic nanoparticle surface comprised the encapsulation of UCNPs by virus capsid leading to the formation of virus-like particles (VLPs). After the process feasibility was confirmed to both dissemble and reassemble the capsid of a brome mosaic virus (BMV), small nanoparticles with an optimized surface were utilized to act as an artificial nucleation grain for self-assembly. These modified UCNPs met the three requirements for encapsulation: a hydrophilic surface to be dispersible in aqueous systems, an absolute diameter below 16 nm to fit in the capsid cavity of the BMV, and a negative surface charge to initiate the self-assembly of the capsomers similar to the viral RNA. In addition to the options described, citric acid was investigated as a potential surface ligand. While silanol and phosphonate groups were inappropriate to induce any kind of self-assembly, a form of unspecific interaction of the viral proteins with carboxylic acids was found both for covalent and non-covalent methods. An exception was citric acid, since it was prone to an irreversible removal from the UCNP surface during the VLP preparation process. However, for all nanoparticles with a modified surface no clear evidence of encapsulation was found as confirmed by both TEM imaging and immunogold staining.
The second research focus of this thesis was the development of a new imaging method of UCNPs. At first, different imaging parameters of the scan mode of a Hidex Plate Chameleon Multilabel Detection Platform with a 980 nm excitation source were studied and optimized for UCNPs of the type NaYF4: Yb3+, Er3+ or NaY4:Yb3+, Tm3+. A collecting time from 250 to 500 ms was sufficient to obtain an upconversion emission signal distinguishable from the background and to minimize laser-induced damages to the sample due to heating effects. Furthermore, both the overall emission of the UCNPs and the emission in a narrow wavelength domain were suitable as the detection signal for the image acquisition. The respective filter or filter combination additionally influenced the signal-to-noise ratio and thus the detection sensitivity. While the green emission of erbium-doped UCNPs was favorable in this regard, limitations of the detector sensitivity in the near infrared range hampered the utilization of the strong near infrared emission of thulium-doped UCNPs for scans with sensitive detection. The lateral resolution of the resulting scan images was reduced to 200 µm providing both a good resolution of luminescent structures and a good discrimination of signal and background. Since a lower scan point distance resulted in longer scan times without additional structural information, a lateral resolution of 200 µm was defined as the lower limit of the lateral resolution of the scan modus. Finally, a limit of detection of 1 ng was determined for both erbium- and thulium-doped UCNPs with high accuracy regardless of the emission utilized as the detection signal.
The applicability of this optimized process to real samples was demonstrated for both electrophoresis gels and lateral flow assays. The imaging of these gels and assays showed a high accuracy and reproducibility and allowed a good discrimination of the UCNP signal from the background and an illustration of differences in the UCNP concentrations or sample materials. Furthermore, the downconversion emission of fluorescein doped in the silica shell of the UCNPs allowed a comparison between the imaging methods based either on up- and downconversion. In addition to a high conformity of the images regarding the position and intensity of the gel bands the absence of any signal from the fluorophore in the upconversion scan images of the gels confirmed a high discriminability of both signal types. This enables a bimodal readout. Moreover, the evaluation of the lateral flow assays yielded a limit of detection of the exemplary analyte "Schistosoma circulating anodic antigen (CAA)" of 44 or 64 pg/mL for the wet and dry condition of the array, respectively. For these measurements the the overall emission of the erbium-doped UCNPs was utilized as the detection signal. Consequently, a high sensitivity of this new imaging method was evident compared to other instrument options.
Finally, the scan mode of the Chameleon reader was also utilized for studies about a potential enhancement of the upconversion emission by surface plasmon resonance of a gold surface. Both NaYF4: Yb3+, Er3+ or NaY4:Yb3+, Tm3+ were applied on a gold or silica surface of a commercial wafer with gold electrodes whose complete surfce was modified before with the same functionality to ensure the same chemical properties. The comparison of the emission intensities of UCNP on the different surface materials indicated a strong dependency of the enhancement effect on the emission wavelength. While the intensity of the green or near infrared emission of erbium- or thulium-doped UCNPs was increased by the gold surface, the overall emission of both UCNP types was reduced indicating a simultaneous quenching of the upconversion emission at other wavelengths.
Übersetzung der Zusammenfassung (Deutsch)
Ein Schwerpunkt dieser Arbeit war die Oberflächenmodifikation von aufwärtskonvertierenden Nanopartikeln (eng.: upconverting nanoparticles, UCNP). Eine Vielzahl verschiedener Funktionalitäten wurde dafür auf der Nanopartikeloberfläche eingeführt. Das Aufbringen einer Silikaschicht mit einer vorzugsweise gleichzeitigen Silanisierung erwies sich dabei als praktischer Weg, um sowohl eine für ...
Übersetzung der Zusammenfassung (Deutsch)
Ein Schwerpunkt dieser Arbeit war die Oberflächenmodifikation von aufwärtskonvertierenden Nanopartikeln (eng.: upconverting nanoparticles, UCNP). Eine Vielzahl verschiedener Funktionalitäten wurde dafür auf der Nanopartikeloberfläche eingeführt. Das Aufbringen einer Silikaschicht mit einer vorzugsweise gleichzeitigen Silanisierung erwies sich dabei als praktischer Weg, um sowohl eine für bioanalytische Anwendungen wichtige hydrophile Oberfläche als auch eine für anschließende Modifikationen zugängliche Funktionalität zu erzeugen. Die Verwendung von Silanol-, Amin-, Carboxyl- oder Phosphonatgruppen ergaben UCNPs mit stark unterschiedlichen Dispersionsstabilitäten und Oberflächenladungen. Sowohl für eine Aminmodifikation als auch für nicht modifizierte Silanolgruppen einer reinen Silikahülle wurde eine starke Aggregation festgestellt, wobei eine Verstärkung dieses Prozesses bei einer Dickenverringerung der Silikahülle auftrat. Desweiteren führten Phosphonatgruppen auf der Oberfläche zur Bildung von Aggregaten mit einheitlicher Größe und Form. Demgegenüber lieferte ein optimierter Modifikationsprozess zur Anbringung von Carbonsäuren auf die Nanopartikeloberfläche monodisperse UCNPs mit einem Durchmesser von 13 nm und einer hohen Stabilität in wässriger Dispersion. Die überwiegende Anwesenheit einzelner Nanopartikel in großer Anzahl wurde durch Untersuchungen mittels dynamischer Lichtstreuung und Transmissions-elektronenmikroskopie bestätigt. Diese hohe Monodispersität konnte auch bei einem Ligandenaustausch mit dem Polymer Polyacrylsäure realisiert werden. Dafür wurde die hydrophobe Ölsäure vorher durch BF4--Ionen ersetzt, um die anschließende Modifikation mit dem Polymer unter einfacheren Prozessbedingungen und mit geringerem Zeitaufwand zu ermöglichen.
Außerdem wurde die Kupfer-katalysierte Azid-Alkin-Cycloaddition als potenzielle Kupplungsreaktion untersucht, da sie die Vorteile der Konzepte "Click-Chemie" und "Bioorthogonalität" in sich vereinte. Die zugehörigen Alkin- und Azidgruppen wurden mittels einer Silanisierung der Silika-beschichteten UCNPs an die Nanopartikeloberfläche gebunden. Die erhaltenen Nanopartikel unterschieden sich drastisch in ihrer Dispersionsstabilität. Während eine Azid-funktionalisierte Oberfläche einen gewissen Grad an Stabilisierung ausübte, führten Alkinfunktionalitäten in kürzester Zeit zu einer starken Aggregation und Ausfällung der Nanopartikel. Beide funktionelle Gruppen erlaubten jedoch eine effiziente und höchst spezifische Anbindung des jeweiligen Gegenstücks durch eine Clickreaktion, testweise gezeigt mit einem passenden Fluorophor. Dabei wurde auch die entscheidende Rolle des Kupfer(I)-Katalysators demonstriert. Eine gut durchführbare Oberflächen¬modifikation mittels einer Kupfer-katalysierte Azid-Alkin-Cycloaddition wurde durch die Ankopplung von komplexeren Molekülen, die biochemische oder zusätzlich stabilisierende Funktionalitäten hatten, bewiesen. Eine gleichzeitige Modifikation der UCNPs mit Azid- und Carboxylgruppen führte zu einer erhöhten Nanopartikelstabilität verglichen mit einer reinen Azidfunktionalisierung.
Zur Erzeugung einer biomimetischen Nanopartikeloberlfäche wurden UCNPs mit einem Viruskapsid umhüllt. Dies führte zur Bildung von Virus-ähnlichen Partikeln (engl.: virus-like particles, VLPs). Nachdem die Umsetzbarkeit der Prozesse zum Auseinander- und Zusammenbauen von Kapsiden des Brommosaik-Virus (BMV) überprüft wurde, wurden kleine Nanopartikel mit einer optimierten Oberfläche verwendet, um als künstliche Nukleationskeime für die Selbstorganisation der Virusproteine zu dienen. Diese modifizierten UCNPs wiesen Eigenschaften auf, die die drei Anforderungen für eine Einkapselung erfüllten: eine hydrophile Oberfläche für ein mögliches Dispergieren in wässrigen Systemen, einen Durchmesser von unter 16 nm, um in den Kapsidhohlraum des BMV zu passen und eine negative Oberflächenladung für die Initiierung des Selbstzusammenbaus der Kapsomere wie mit der viralen RNA. Während Silanol- und Phosphonatgruppen ungeeignet waren, um eine Selbstorganisation der Kapsomere zu initiieren, wurden unspezifische Interaktionen der Virenproteine mit Carbonsäuren, die entweder durch kovalente oder nicht-kovalente Wechselwirkungen auf die Nanopartikeloberfläche eingeführt wurden, gefunden. Die zusätzlich untersuchte Oberflächenmodifikation mit Zitronensäure bildete eine Ausnahme, da dieser Ligand zu einer irreversiblen Ablösung von der UCNP-Oberfläche während der VLP-Herstellung neigte. Ein eindeutiger Beweis für eine Umhüllung eines Nanopartikels mit modifizierter Oberfläche wurde aber nicht gefunden, weder in TEM-Aufnahmen noch bei einer Immunogold-Anfärbung.
Der zweite Forschungsschwerpunkt dieser Arbeit war die Entwicklung einer neuen Abbildungs-methode von UCNPs. Zuerst wurden verschiedene Darstellungsparameter des Scanmodus einer "Hidex Plate Chameleon Multilabel Detection Platform" mit einer 980 nm Anregungsquelle untersucht und für UCNPs des Typs NaYF4: Yb3+, Er3+ oder NaY4:Yb3+, Tm3+ optimiert. Eine Detektionszeit von 250 bis 500 ms war ausreichend, um ein vom Hintergrund unterscheidbares Signal der Aufwärtskonversion-Emission zu erhalten und um Schäden an der Probe durch Erhitzungseffekte zu minimieren. Desweiteren waren sowohl die Gesamtemission als auch die Emission in einem schmalen Wellenlängenbereich als Detektions¬signal für eine Bilderzeugung geeignet. Der jeweilige Filter oder die jeweilige Filterkombination beeinflusste auch das Signal-zu-Rauschen-Verhältnis und somit die Detektions¬empfindlichkeit. Während die grüne Emission von Erbium-dotierten UCNPs sich diesbezüglich besonders auszeichnete, hemmte eine geringe Detektor¬empfindlichkeit im Nahinfrarot die Verwendbarkeit der starken Nahinfrarotemission von Thulium-dotierten UCNPs für Scans mit einer nachweisstarken Detektion. Die laterale Auflösung der Scanbilder wurde auf 200 µm verringert, wobei sowohl eine gute Auflösung lumineszierender Strukturen als auch eine gute Unterscheidbarkeit von Signal und Hintergrund erreicht wurde. Da ein geringerer Abstand als 200 µm zwischen den Scanpunkten eine längere Scandauer ohne zusätzliche strukturelle Informationen zur Folge hatte, wurde diese laterale Auflösung als untere Auflösungsgrenze des Scan-Modus definiert. Schließlich wurde eine Nachweisgrenze von 1 ng mit hoher Genauigkeit mittels des Scanmodus sowohl für Erbium- wie auch Thulium-dotierten UCNPs realisiert. Dabei zeigte sich, dass diese niedrigste Konzentration von der als Detektionssignal verwendeten Emission unabhängig war.
Die Anwendung dieses optimierten Abbildungsprozesses auf Realproben wurde anhand von Elektrophoresegelen und Lateral-Flow-Assays gezeigt. Die Abbildung dieser Gele und Assays wies eine hohe Genauigkeit und Reproduzierbarkeit auf und erlaubte eine gute Unterscheidbarkeit des UCNP-Signals vom Hintergrund und eine Darstellung von Unterschieden in der UCNP-Konzentration oder im Probenmaterial. Außerdem erlaubte die abwärtskonvertierende Emission von Fluorescein, das in die Silikahülle der UCNPs eingebracht wurde, einen Vergleich zwischen den auf Aufwärts- oder Abwärtskonversion beruhenden Abbildungsmethoden. Zusätzlich zu einer hohen Übereinstimmung der Bilder bezüglich der Position und Intensität der Gelbanden bewies die Abwesenheit jeglichen Fluorophor-Signals in den Aufwärtskonversion-Bildern der Gele eine gute Unterscheidung beider Signaltypen. Dadurch wird ein bimodales Auslesen ermöglicht. Darüber hinaus ergab die Auswertung der Lateral-Flow-Assays eine Nachweisgrenze von 44 oder 64 pg/mL für den exemplarischen Analyten "Schistosoma circulating anodic antigen (CAA)" im feuchten bzw. trockenen Zustand des Assays. Bei deren Messung wurde die Gesamtemission der Erbium-dotierten UCNPs als Detektionssignal verwendet. Demzufolge ist eine hohe Empfindlichkeit dieser neuen Darstellungs¬methode im Vergleich zu anderen Geräteoptionen offensichtlich.
Schließlich wurde der Scanmodus des Chameleon readers für Untersuchungen der möglichen Verstärkung der Aufwärtskonversion-Emission durch Oberflächenplasmonen einer Goldoberfläche eingesetzt. Sowohl NaYF4: Yb3+, Er3+ als auch NaY4:Yb3+, Tm3+ wurden auf eine Gold- oder Silikaoberfläche eines kommerziellen Wafers mit Goldelektroden aufgetragen, dessen gesamte Oberfläche vorher mit der gleichen Funktionalität modifiziert wurde, um gleiche chemische Eigenschaften sicherzustellen. Der Vergleich der Emissionsintensitäten der UCNP auf den verschiedenen Oberflächenmaterialien bestätigte eine starke Abhängigkeit des Verstärkungseffekts von der Emissionswellenlänge. Während die Intensität der grünen oder nahinfraroten Emission der Erbium- bzw. Thulium-dotierten UCNPs durch die Goldoberfläche verstärkt wurde, wurde die Gesamtemission beider UCNP-Typen verringert. Dies weist auf eine gleichzeitige Löschung der Aufwärtskonversion-emission bei anderen Wellenlängen hin.
Metadaten zuletzt geändert: 25 Nov 2020 23:07
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