| License: Publishing license for publications excluding print on demand (9MB) |
- URN to cite this document:
- urn:nbn:de:bvb:355-epub-335095
| Item type: | Thesis of the University of Regensburg (PhD) |
|---|---|
| Open Access Type: | Primary Publication |
| Date: | 4 April 2017 |
| Referee: | Prof. Dr. Hans-Robert Kalbitzer |
| Date of exam: | 16 March 2016 |
| Institutions: | Biology, Preclinical Medicine > Institut für Biophysik und physikalische Biochemie Biology, Preclinical Medicine > Institut für Biophysik und physikalische Biochemie > Prof. Dr. Dr. Hans Robert Kalbitzer |
| Keywords: | Protein, Mehrdimensionale NMR-Spektroskopie, Molekulare Bioinformatik, Top-Down-Verfahren, AUREMOL, HSQC-Spektrum, Automatische Zuordnung, Modellpeptide, Random-Coil, stereospezifische Zuordnung,Molekulardynamik, SIBASA, RELAX |
| Dewey Decimal Classification: | 500 Science > 570 Life sciences |
| Status: | Published |
| Refereed: | Yes, this version has been refereed |
| Created at the University of Regensburg: | Yes |
| Item ID: | 33509 |
Abstract (German)
Im ersten Teil dieser Arbeit wurden die stereospezifischen Zuordnungen der Seitenkettenamidgruppen der Random-Coil-Modellpeptide Gly-Gly-Asn-Ala-NH2 und Gly-Gly-Gln-Ala-NH2 ermittelt. Stereospezifische Zuordnungen werden meistens mit Hilfe von Datenbanken bereits gelöster Biomoleküle bestimmt. Die bekannteste dieser Datenbanken ist die Biological Magnetic Resonance Data Bank (BMRB). Untersucht ...
Abstract (German)
Im ersten Teil dieser Arbeit wurden die stereospezifischen Zuordnungen der Seitenkettenamidgruppen der Random-Coil-Modellpeptide Gly-Gly-Asn-Ala-NH2 und Gly-Gly-Gln-Ala-NH2 ermittelt. Stereospezifische Zuordnungen werden meistens mit Hilfe von Datenbanken bereits gelöster Biomoleküle bestimmt. Die bekannteste dieser Datenbanken ist die Biological Magnetic Resonance Data Bank (BMRB). Untersucht man die in der BMRB gespeicherten chemischen Verschiebungen genauer, so findet man Inkonsistenzen bei den stereospezifischen Zuordnungen. Es wurde außerdem festgestellt, dass die beiden Programme SHIFTS und SHIFTX, die chemischen Verschiebungen aus den 3D-Strukturen von Peptiden und Proteinen vorhersagen können, Resonanzen ebenfalls stereospezifisch falsch zuordnen können.
Für die stereospezifische Zuordnung wurden NOESY-Spektren der Random-Coil-Peptide von Gly-Gly-Asn-Ala-NH2 und Gly-Gly-Gln-Ala-NH2 aufgenommen. Mit AUREMOL RELAX, das den vollständigen Relaxationsmatrixformalismus verwendet, wurden entsprechende Spektren aus Molekulardynamik (MD) Rechnungen der beiden Tetrapeptide simuliert. Ein Vergleich der experimentellen und simulierten Signalvolumina erbrachte eine eindeutige stereospezifische Zuordnung der Random-Coil-Verschiebungen der Seitenkettenamid- und Hβ-Protonen der beiden Aminosäuren.
Die vorgestellte Methode hat das Potential in zukünftigen Arbeiten auf einen großen Teil aller Aminosäuren übertragen zu werden, um eine vollständige stereospezifische Random-Coil-Verschiebungsdatenbank zu erzeugen.
Im zweiten Teil der Arbeit wurde SIBASA, das neue AUREMOL Modul zur automatischen Zuordnung von HSQC-Spektren und NMR-Protonenresonanzen vorgestellt. SIBASA basiert auf dem Top-Down-Ansatz und bestimmt die vollständige Zuordnung eines Proteins, indem es die optimale Übereinstimmung zwischen experimentellen und mit variablen chemischen Verschiebungen zurückgerechnete NOESY-Spektren findet. Durch den Top-Down-Ansatz ist es möglich 2-D-NOESY-Spektren von großen Proteinen als Informationsquelle der automatische Zuordnung zu verwenden. SIBASA benötigt für die vollständige Zuordnung der Protonen und Stickstoffresonanzen eine 3D-Struktur des Proteins, das 2-D-NOESY- und das 3D 15N-NOESY-HSQC-Spektrum. Die Rückrechnungen der NOESY-Spektren werden wieder mit AUREMOL RELAX erzeugt. RELAX wertet zudem MD-Trajektorien aus, um Informationen über lokale Beweglichkeit im Protein erhalten. Mithilfe der Programme SHIFTS und SHIFTX2 kann SIBASA Wahrscheinlichkeitsdichteverteilungen der chemischen Verschiebungen der zuzuordnen Kerne aus der MD-Trajektorie des betrachten Proteins vorhersagen, was zur Verbesserung der Zuverlässigkeit und Geschwindigkeit der automatischen Zuordnung führt.
Die optimale Übereinstimmung der experimentellen und der zurückgerechneten NOESY-Spektren wird durch den Threshold-Accepting-Algorithmus, der in mehreren Instanzen mit verschiedenen Startzuordnung ausgeführt wird, bestimmt. Mehrere Instanzen helfen SIBASA die wahrscheinlichste vollständige Zuordnung zu finden und sind Voraussetzung für die Verifikation. SIBASA ist in der Lage, jeder automatisch gefundene Zuordnung eine Wahrscheinlichkeit zuzuordnen.
Die automatische Zuordnung wurde mit den NOESY-Spektren und den Röntgenstrukturen der Proteine von S. aureus HPr (H15A) (88 Aminosäuren), von Thioredoxin Plasmodium falciparum (PfTrx) (104 Aminosäuren) und von Ras(T35S)-GppNHp (166 Aminosäuren) getestet. SIBASA konnte 91,3 % der Resonanzen von HPr (H15A), 81,9 % der Resonanzen von PfTrx und 77,6 % der Resonanzen von Ras(T35S)-GppNHp richtig zuordnen. Eine Verifikation auf dem signifikanten Niveau ermöglicht es, einen großen Teil der falschen Zuordnungen von den richtigen zu trennen. Insgesamt erhielten 77,8 % der automatisch gefunden Resonanzzuordnungen von HPr (H15A), 77,5 % der gefunden Resonanzzuordnungen von PfTrx und 66,8 % der Resonanzzuordnungen von Ras(T35S)-GppNHp von SIBASA eine Wahrscheinlichkeit von mindestens 95 %. Von diesen Resonanzen sind beim HPr (H15A) nur 3,5 %, beim PfTrx nur 9,7 % und beim Ras(T35S)-GppNHp nur 10,2 % falsch zugeordnet worden.
Es wurde anhand der drei Proteine gezeigt, dass SIBASA in der Lage ist HSQC-Spektren sicher teilzuordnen. Das HSQC-Spektrum von HPr (H15A) konnte von SIBASA vollständig richtig zugeordnet werden. Beim PfTrx waren 90 % und beim Ras(T35S)-GppNHp 88 % der automatisch gefundenen HSQC-Zuordnungen richtig. Vertraut man nur Zuordnungen von HSQC-Signalen, die von SIBASA bestätigt wurden, so konnten 82 % der Signale von HPr (H15A), 72 % der Signale von PfTrx und 68 % der HSQC-Signale des Ras(T35S)-GppNHp richtig zugeordnet werden. In keinem Fall enthielt die Gruppe der bestätigten Signale eine falsche Zuordnung.
Das vorgestellte Modul ermöglicht es für die Wirkstoffentwicklung wichtige [1H,15N]-HSQC-Spektren automatisch zuzuordnen, ohne auf die umständliche Markierung der Proteine mit dem Isotop 13C zurückgreifen zu müssen, wobei eine Kristall- oder eine NMR-Struktur eines homologen Proteins verfügbar ist.
Translation of the abstract (English)
In the first part of this work the stereospecific assignments of the side chain amide groups of the random-coil peptides Gly-Gly-Asn-Ala-NH2 and Gly-Gly-Gln-Ala-NH2 were determined. Usually a database of already solved biomolecules helps with the stereospecific assignment of resonance lines. The Biological Magnetic Resonance Bank (BMRB) is one of the most often used databases for this case. An ...
Translation of the abstract (English)
In the first part of this work the stereospecific assignments of the side chain amide groups of the random-coil peptides Gly-Gly-Asn-Ala-NH2 and Gly-Gly-Gln-Ala-NH2 were determined. Usually a database of already solved biomolecules helps with the stereospecific assignment of resonance lines. The Biological Magnetic Resonance Bank (BMRB) is one of the most often used databases for this case. An analysis of its data has shown that a great part of the stored stereospecific assignments are not correct. The two programs SHIFTS and SHIFTX, which predict chemical shifts of resonance lines from 3D structures from peptides and proteins, also assign chemical shifts stereospecifically wrong.
For the stereospecific assignment of the random-coil-peptides Gly-Gly-Asn-Ala-NH2 and Gly-Gly-Gln-Ala-NH2, 800 MHz Nuclear Overhauser Spectroscopy (NOESY) spectra were recorded. In addition equivalent NOESY spectra were back-calculated by AUREMOL RELAX, which uses the full relaxation matrix formalism, from molecular dynamics (MD) trajectories of the peptides. The stereospecific assignments of side chain amide and of the Hβ protons were obtained through the comparison of the experimental and back-calculated spectra.
In general it would be possible to use this method on all remaining random-coil peptides to create a complete database of stereospecific random-coil chemical shifts in the future.
In the second part, the automatic assignment module SIBASA, which is able to assign the cross peaks in HSQC spectra and the resonances of the Hα and side chain protons, is presented. SIBASA is based on the Top-Down approach and finds the complete assignments by optimizing the match between experimental and with variable chemical shifts back-calculated NOESY spectra. By doing so, SIBASA is able to evaluate spectra with strong signal overlap, like 2-D NOESY spectra of larger proteins and is able to use these high resolution spectra with excellent signal-to-noise-ratio as primary source of information. For the complete resonance assignment of the 1H protons and the 15N nitrogen, only a similar 3-D structure, a [1H-1H] 2-D NOESY spectrum and a 3-D 15N NOESY-HSQC spectrum are necessary. Neither an expensive 13C labeled sample nor multiple measuring time consuming 3-D NMR spectra are required. The back-calculated spectra are simulated by AUREMOL RELAX, which uses the full relaxation matrix formalism a structural ensemble and the dynamic parameters from a Molecular Dynamics (MD) trajectory. SIBASA also uses the programs SHIFTS and SHIFTX2 on the MD trajectory to predict the chemical shifts, which contributes to the speed and reliability of the automatic assignment.
The optimal match between the variable back-calculated and the experimental spectra is determined by the Threshold-Accepting-Algorithm in multiple instances with different start configurations and random seeds. By using multiple instances, SIBASA finds the most likely arrangement of the back-calculated NOESY peaks and is able to verify each resonance assignment individually. As a result SIBASA calculates a probability for every assignment.
Three proteins of different size, S. aureus HPr (H15A) (88 amino acids), Plasmodium falciparum Thioredoxin (PfTrx) (104 amino acids) and Ras(T35S)-GppNHp (166 amino acids) were assigned automatically by SIBASA in this work. SIBASA was able to find 91.3 % of the resonance assignments of HPr (H15A), 81.9 % of the resonance assignments of PfTrx and 77.6 % of the resonance assignments of Ras(T35S)-GppNHp correctly. Through verification on the significant level the fraction of wrong assignments in the result were reduced to 3.5 % in the case of HPr (H15A), to 9.7 % in the case of PfTrx and to 10.2 % in the case of Ras(T35S)-GppNHp, while overall 77.8 % for HPr (H15A), 77.5 % for PfTrx and 66.8 % of the assignments of Ras(T35S)-GppNHp were verified.
Before verification the automatic assignment of the HSQC spectrum of HPr (H15A) was complete and correct, the fraction of correct assignments in the HSQC spectrum of PfTrx was 90 % and for the HSQC spectrum of Ras(T35S)-GppNHp the fraction of correct assignments was 88 %. After verification the 82 % of the cross peaks in the HSQC spectrum of HPr (H15A), 72 % of the cross peaks in the HSQC spectrum of PfTrx and 68 % of the cross peaks in the HSQC spectrum of Ras(T35S)-GppNHp were correct assigned. In all three cases there were no wrong assignments in the group of verified resonances.
The module presented in this work makes an automatic assignment of [1H-,15N] HSQC spectra, which are essential for drug design, without an expensive 13C labeled sample of the target protein possible, when a crystal structure or a NMR Structure of a homologous protein is available.
Metadata last modified: 25 Nov 2020 15:37
Owner only: item control page
Download Statistics