| License: Publishing license for publications excluding print on demand (3MB) |
- URN to cite this document:
- urn:nbn:de:bvb:355-epub-336479
- DOI to cite this document:
- 10.5283/epub.33647
| Item type: | Thesis of the University of Regensburg (PhD) |
|---|---|
| Date: | 2 October 2017 |
| Referee: | Prof. Dr. Reinhard Sterner |
| Date of exam: | 7 April 2016 |
| Institutions: | Biology, Preclinical Medicine > Institut für Biophysik und physikalische Biochemie Biology, Preclinical Medicine > Institut für Biophysik und physikalische Biochemie > Prof. Dr. Reinhard Sterner |
| Projects: | Kooperationsprojekt Lisando GmbH |
| Keywords: | Artilysin(R), Antimykobakterielle Proteinwirkstoffe, Mykobakteriophagen, Lysine |
| Dewey Decimal Classification: | 500 Science > 500 Natural sciences & mathematics |
| Status: | Published |
| Refereed: | Yes, this version has been refereed |
| Created at the University of Regensburg: | Yes |
| Item ID: | 33647 |
Abstract (German)
In dieser Arbeit wurden die Lysine A und B von vier ausgewählten Mykobakteriophagen charakterisiert. Zudem wurden für ausgewählte Lysine Fusionen mit antimykobakteriellen Peptiden, sogenannte Artilysine erzeugt. Lysine und Artilysine wurden anschließend mit unterschiedlichen Methoden auf ihre antimykobakterielle Wirkung untersucht und geeignete Kandidaten für die Wirkstoffentwicklung ...
Abstract (German)
In dieser Arbeit wurden die Lysine A und B von vier ausgewählten Mykobakteriophagen charakterisiert. Zudem wurden für ausgewählte Lysine Fusionen mit antimykobakteriellen Peptiden, sogenannte Artilysine erzeugt. Lysine und Artilysine wurden anschließend mit unterschiedlichen Methoden auf ihre antimykobakterielle Wirkung untersucht und geeignete Kandidaten für die Wirkstoffentwicklung identifiziert.
Bei der rekombinanten Expression zeigte sich, dass die Lysine trotz optimierter Puffer einen hohen Anteil in der unlöslichen Fraktion aufwiesen. So konnte nur für drei Lysine A und ein Lysin B eine lösliche Expression in ausreichender Menge erhalten werden. Außerdem wurde, vermutlich aufgrund der hohen Oberflächenhydrophobizität, eine starke Aggregationstendenz der Lysine beobachtet. Die Untersuchung des Oligomerisierungszustandes zeigte, dass die Lysine A Oligomere bildeten. Anhand von Lysin A Deletionsvarianten wurde gefolgert, dass die Zellwand-Bindedomäne diese intermolekulare Interaktion vermittelt. Die in vitro Aktivität der Lysine A und der Lysine B wurde charakterisiert. Aufgrund eines insgesamt hohen in vitro Aktivitätsverlustes während der Lagerung wurde für zwei ausgewählte Lysine B eine Optimierung des Lagerungspuffers durchgeführt, wodurch eine deutliche Verbesserung erreicht werden konnte. Exemplarisch wurde für ein Lysin B eine thermische Stabilisierung mittels Mutagenese durchgeführt, wobei eine Erhöhung der Schmelztemperatur von + 9,6 °C erreicht werden konnte. Für in der Folge erzeugte Artilysine wurde generell eine geringere lösliche Expressionsausbeute als für die entsprechenden Lysine beobachtet, wobei diese Beobachtung auf eine Kombination verschiedener Faktoren, wie eine höhere Toxizität für die Expressionszellen oder eine stärkere Aggregationstendenz, zurückgeführt wurde. Diese Unterschiede zeigten sich auch bei der in vitro Aktivität der Lysine B.
Die Untersuchungen der antimykobakteriellen Aktivität der Lysine und Artilysine ergab, dass die Lysine A bei der Zugabe von außen keine Wirkung auf die Mykobakterien zeigten. Die Mykomembran stellt, wie vermutet, somit eine Barriere für diese Proteine dar. Das untersuchte Lysin B zeigte hingegen bereits im nanomolaren Bereich eine Wachstumsinhibition auf M. smegmatis und ergab eine signifikante Reduktion der Kolonien bildenden Einheiten auf M. smegmatis und auf M. fortuitum. Die weiteren Untersuchungen zeigten, dass dieses Lysin B auch auf dem langsam wachsenden M. bovis BCG eine antimykobakterielle Wirkung aufwies. Eine Verbesserung dieser Aktivität durch die Kombination aus Lysin A und Lysin B konnte nicht beobachtet werden. Die Untersuchung der Artilysine ergab, dass die Fusion mit den ausgewählten AMPs zu keiner Verbesserung der Aktivität auf M. smegmatis und M. fortuitum führte, jedoch zwei Artilysine A, im Gegensatz zu dem unmodifizierten Lysin A, eine Wachstumsinhibition und eine deutliche Reduktion der lebenden Zellen auf M. bovis ergaben. Dieses Lysin A konnte demnach durch die Fusion mit diesen Peptiden die Mykomembran von M. bovis überwinden, was die Anwendbarkeit der Artilysin Technologie auf Mykobakterien belegte.
Eine folgende Visualisierung des antimykobakteriellen Effektes mittels Transmissions-Elektronen-Mikroskopie zeigte, dass die Aktivität des untersuchten Lysin B nicht zu einer Lyse der Zellen, sondern zu einem Verlust von zytoplasmischem Material führte. Vermutlich erzeugte die Spaltung der kovalenten Verbindung zwischen den Mykolsäuren und dem Arabinogalaktan eine Destabilisierung der Mykomembran. Während die Behandlung mit Lysin A keinen Effekt auf die Zellen hatte, zeigte die Mischung von Lysin A und Lysin B nicht nur einen Verlust des zytoplasmischem Materials, sondern auch eine massive Fragmentierung der Zellen. Eine Destabilisierung der Mykomembran machte somit das Peptidoglykan für das Lysin A zugänglich.
Translation of the abstract (English)
The lysins A and B of four selected mycobacteriophages were characterized in this thesis. Furthermore so called Artilysins were produced by the fusion of selected lysins with antimycobacterial peptides. Subsequently various methods were used to characterize the antimycobacterial effect of the lysins and Artilysins and to identify suitable candidates for the antimycobacterial agent ...
Translation of the abstract (English)
The lysins A and B of four selected mycobacteriophages were characterized in this thesis. Furthermore so called Artilysins were produced by the fusion of selected lysins with antimycobacterial peptides. Subsequently various methods were used to characterize the antimycobacterial effect of the lysins and Artilysins and to identify suitable candidates for the antimycobacterial agent development.
Recombinant expression resulted in mainly insoluble lysins, even in case optimized buffers were used. Sufficient soluble expression yields were obtained only for three lysins A and one lysin B. Furthermore a strong aggregation tendency was observed for the lysins, which might be caused by the high surface hydrophobicity of these proteins. Further investigation of the state of oligomerisation showed, that all lysins A formed oligomers. Experiments with deletion variants lacking the cell wall binding domain indicated a significant role of the cell wall binding domain for mediating this intermolecular interaction. The in vitro activity of the produced lysins A and B was characterized. Due to high in vitro activity losses during storage, a buffer optimization of the storage buffer was performed with two selected lysins B, whereas conditions were found which caused a significant improvement. Furthermore mutagenesis experiments were performed to increase the thermal stability of a selected lysin B, whereas an increase of + 9,6 °C was achieved. A reduced soluble expression yield was observed for the subsequently constructed Artilysins compared to the respective lysins. This effect may result from different factors like a higher toxicity on the bacterial cells used for the protein expression or an increased aggregation tendency. However, this effect differed for the Artilysins investigated and was also observed for the lysin B in vitro activity.
The characterization of the antimycobacterial activity of the lysins and Artilysins displayed, that lysins A had no effect on the mycobacteria when applied from the outside. Thus the mycomembran seems to act as a barrier for these proteins. The studied lysin B however caused a growth inhibition of M. smegmatis at nanomolar concentrations and yielded a significant reduction of the colony forming units of M. smegmatis and M. fortuitum. Additional experiments showed, that lysin B also exhibits an antimycobacterial activity on M. bovis, a member of the group of the slow growing mycobacteria. However, no increase of the antimycobacterial activity was observed for the mixture of lysin A and lysin B. Experiments with the Artilysins A and B also showed no improvement of the antimycobacterial activity on M. smegmatis and M. fortuitum. In contrast, two Artilysins A caused a growth inhibition and a significant reduction of the living cells of M. bovis, while the respective lysin A did not. Thus the fusion of peptides to the lysin A enabled the Artilysins A to pass the mycomembrane of M. bovis, which demonstrates the applicability of the Artilysin-Technology on mycobacteria.
A subsequent visualization of the antimycobacterial effect using transmission electron microscopy showed, that activity of lysin B did not result in lysis of the mycobacterial cells but in a loss of cytoplasmic material. Presumably a destabilization of the mycomembrane was caused by cleavage of the covalent bond of mycolic acids to arabinogalactan. Whereas no effect was observed for treatment with lysin A, not only a loss of cytoplasmic material, but also a fragmentation of the bacterial cells was observed upon application with a mixture of lysin A and lysin B. This indicated, that the peptidoglycan gets accessible by the destabilization of the mycomembrane.
Metadata last modified: 25 Nov 2020 22:46
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