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- URN to cite this document:
- urn:nbn:de:bvb:355-epub-349891
| Item type: | Thesis of the University of Regensburg (PhD) |
|---|---|
| Open Access Type: | Primary Publication |
| Date: | 7 November 2017 |
| Referee: | Prof. Dr. Wolfgang Seufert |
| Date of exam: | 7 November 2016 |
| Institutions: | Biology, Preclinical Medicine > Institut für Biochemie, Genetik und Mikrobiologie Biology, Preclinical Medicine > Institut für Biochemie, Genetik und Mikrobiologie > Cell Cycle Control Biology, Preclinical Medicine > Institut für Biochemie, Genetik und Mikrobiologie > Cell Cycle Control > Prof. Dr. Wolfgang Seufert |
| Keywords: | APC/C; degron; Cdh1; Cdc20; cell cycle; Zellzyklus; Cdk phosphorylation; Cdk Phosphorylierung; Ubiquitin-Ligase |
| Dewey Decimal Classification: | 500 Science > 500 Natural sciences & mathematics 500 Science > 570 Life sciences |
| Status: | Published |
| Refereed: | Yes, this version has been refereed |
| Created at the University of Regensburg: | Yes |
| Item ID: | 34989 |
Abstract (German)
Der APC/C (anaphase-promoting complex/cyclosome) ist eine konservierte E3-Ubiquitin-Ligase mit essentiellen Funktionen in der Kontrolle des eukaryotischen Zellteilungszyklus. Die Ubiquitinierung von Substraten durch den APC/C erfordert die Bindung von Aktivator-Proteinen, die den APC/C in einer Substrat-spezifischen Weise und zu unterschiedlichen Zeitpunkten im Zellzyklus aktivieren. Der frühe ...
Abstract (German)
Der APC/C (anaphase-promoting complex/cyclosome) ist eine konservierte E3-Ubiquitin-Ligase mit essentiellen Funktionen in der Kontrolle des eukaryotischen Zellteilungszyklus. Die Ubiquitinierung von Substraten durch den APC/C erfordert die Bindung von Aktivator-Proteinen, die den APC/C in einer Substrat-spezifischen Weise und zu unterschiedlichen Zeitpunkten im Zellzyklus aktivieren. Der frühe Aktivator Cdc20 bindet den APC/C in der Metaphase und initiiert durch die Ubiquitinierung von Securin und der Cycline die Trennung der Schwester-Chromatiden sowie die Inaktivierung der Cyclin-abhängigen Kinasen (Cdks). Am Ende der Mitose wird Cdc20 durch den späten Aktivator Cdh1 ersetzt, der die Degradation der Cycline bis in die G1-Phase aufrecht erhält und durch Ubiquitinierung zahlreicher Mitose-Proteine den Austritt aus der Mitose unterstützt. Die Aktivatoren sind durch eine WD40-Domäne charakterisiert, die konservierte Rezeptorstellen für die Bindung von Substrat-spezifischen Sequenzmotiven, wie die D- oder die KEN-Box, enthält. Dennoch unterscheiden sich die Aktivatoren aus noch unvollständig verstandenen Gründen in ihrer Substratspezifität. Um eine geordnete Degradation der APC/C-Substrate zu gewährleisten, wird die Bindung der Aktivatoren an den APC/C durch multiple Mechanismen reguliert, zu denen die APC/C-Cdh1-vermittelte Degradation von Cdc20 und die inhibitorische Phosphorylierung von Cdh1 durch Cdks zählen. Cdh1 wird an zahlreichen Positionen phosphoryliert, doch die Notwendigkeit und der präzise Wirkmechanismus dieser multiplen Phosphorylierung wurden noch nicht im Detail geklärt.
Um die Regulation der Aktivatoren im Zellteilungszyklus von S. cerevisiae besser zu verstehen, wurden die Rolle individueller Cdk-Phosphorylierungsstellen für die Inhibition von Cdh1 analysiert sowie die minimale Abbausequenz (Degron) für die Cdh1-vermittelte Proteolyse von Cdc20 charakterisiert. Zudem wurde die Aktivierung des APC/C durch die N-terminale Domäne von Cdc20 und die Ursache für die unterschiedliche Substratspezifität der Aktivatoren untersucht.
In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass sich die N-terminalen Cdk-Phosphorylierungs-stellen von Cdh1 in zwei autonome Subgruppen unterteilen lassen, welche die Interaktion von Cdh1 mit dem APC/C auf unterschiedliche Weise regulieren. Die Phosphorylierung der Cdk-Konsensussequenzen 1-3 inaktiviert eine bipartite Kernlokalisationssequenz (NLS) und verhindert die Akkumulation von Cdh1 im Zellkern. Die übrigen sechs Phosphorylierungs-stellen haben keinen Einfluss auf die subzelluläre Lokalisation von Cdh1, sondern beeinträchtigen nach Phosphorylierung spezifisch die Bindung an den APC/C. Die Cdk-Phosphorylierungsstellen 4-9 befinden sich in der Nähe von kürzlich identifizierten APC/C-Bindemotiven in einer Anordnung, die in humanem Cdh1 konserviert ist. Sowohl die Inaktivierung der NLS als auch die Inhibition der APC/C-Bindemotive sind für die negative Regulation von Cdh1 durch Cdk1-Phosphorylierung von Bedeutung. Dies deutet an, dass APC/C-Cdh1 im Zellkern aktiv ist.
Diese Schlussfolgerung konnte an Hand der Kartierung des Degrons von Cdc20 für die APC/C-Cdh1-vermittelte Degradation untermauert werden. Das Cdc20-Degron umfasst die N-terminalen 80 Aminosäuren des Proteins und dient als autonome Degradationsdomäne für eine APC/C-Cdh1-spezifische Proteolyse in vivo. Neben einer D-Box als APC/C-Erkennungs-signal ist eine NLS ein essentieller Bestandteil des Degrons. In der Tat ist die Lokalisation des Cdc20-Degrons im Zellkern eine wichtige Voraussetzung für dessen APC/C-Cdh1-vermittelte Proteolyse. Durch eine gezielte Lokalisierung des Degrons in verschiedenen Zell-kompartimenten konnte belegt werden, dass die Aktivität von APC/C-Cdh1 auf den Zellkern beschränkt ist. Zudem wurden Hinweise darauf gefunden, dass die Erkennung des Cdc20-Degrons durch APC/C-Cdh1 durch eine Cdk-Phosphorylierungsstelle in der Nähe der D-Box reguliert sein könnte.
Darüber hinaus konnte in dieser Arbeit nachgewiesen werden, dass die N-terminale Domäne von Cdc20 hinreichend ist, um den APC/C zu aktivieren. Dabei stellte sich heraus, dass die D-Box von Cdc20 nicht nur die Degradation des Aktivators vermittelt, sondern auch eine Rolle für die Aktivierung des APC/C spielt. Die Entfernung der D-Box wirkte sich jedoch nur auf die Cdc20-Funktion aus, wenn die Fähigkeit zur Bindung des APC/C bereits beeinträchtigt war, sodass die D-Box möglicherweise der Feinjustierung der APC/C-Cdc20-Interaktion dient.
Die Analyse von Chimären aus Cdc20 und Cdh1 zeigte, dass die N-terminalen Domänen austauschbare Regulations- und Aktivierungselemente sind und die Substratspezifität der Aktivatoren durch die C-terminalen WD40-Domänen festgelegt wird. Mit Hilfe eines genetischen Screens wurden Bereiche in der WD40-Domäne von Cdh1 identifiziert, die zu der Diskriminierung zwischen Cdc20- und Cdh1-Substraten beitragen und spezifisch die Erkennung des Cdc20-Substrats Pds1 betreffen. Dies lässt vermuten, dass die Aktivatoren zusätzlich zu der Bindung von D- und KEN-Boxen individuelle Interaktionen mit ihren Substraten eingehen.
Translation of the abstract (English)
The anaphase-promoting complex/cyclosome (APC/C) is a conserved E3 ubiquitin ligase that has essential functions in the control of the eukaryotic cell division cycle. Substrate ubiquitination by the APC/C depends on related activator proteins that bind the APC/C at different times during the cell cycle and activate the ubiquitin ligase towards distinct sets of substrates. The early activator ...
Translation of the abstract (English)
The anaphase-promoting complex/cyclosome (APC/C) is a conserved E3 ubiquitin ligase that has essential functions in the control of the eukaryotic cell division cycle. Substrate ubiquitination by the APC/C depends on related activator proteins that bind the APC/C at different times during the cell cycle and activate the ubiquitin ligase towards distinct sets of substrates. The early activator Cdc20 binds the APC/C in metaphase and initiates sister-chromatid separation and inactivation of cyclin-dependent kinases (Cdks) by ubiquitination of securin and cyclins, respectively. At the end of mitosis, Cdc20 is replaced by the late activator Cdh1, which facilitates mitotic exit by targeting several mitotic proteins for degradation and maintains the destruction of cyclins during the following G1 phase. Cdc20 and Cdh1 are characterized by WD40 domains that carry conserved receptor sites to recognize specific sequence motifs in substrates, such as D- and KEN-boxes. However, for reasons that are still incompletely understood, Cdc20 and Cdh1 confer different substrate specificities to the APC/C. Multiple mechanisms control the binding of the activators to the APC/C, including APC/C-Cdh1-mediated proteolysis of Cdc20 and inhibitory phosphorylation of Cdh1 by Cdks, to ensure ordered degradation of APC/C substrates. Cdh1 is known to be phosphorylated at numerous Cdk sites, but the requirement and the precise mechanism of this multisite phosphorylation have remained unclear. This study analyzed the role of individual Cdk sites for negative control of Cdh1 and characterized the minimal degradation sequence (degron) of Cdc20 for Cdh1-mediated proteolysis to better understand the regulation of Cdc20 and Cdh1 in the cell division cycle of S. cerevisiae. In addition, APC/C activation by the N-terminal domain of Cdc20 and the molecular basis of the distinct substrate specificities of the activators were examined.
This work revealed that the N-terminal Cdk phosphorylation sites of Cdh1 are organized in autonomous subgroups that regulate the interaction of Cdh1 with the APC/C by distinct mechanisms. Phosphorylation of Cdk sites 1-3 inactivates a bipartite nuclear localization sequence (NLS) and prevents accumulation of Cdh1 in the nucleus. In contrast, the remaining six Cdk phosphorylation sites do not influence the subcellular localization of Cdh1, but their phosphorylation specifically inhibits the binding of Cdh1 to the APC/C. Cdk sites 4 – 9 reside in close proximity to recently identified APC/C interaction motifs in a pattern conserved with the human Cdh1 ortholog. Both inactivation of the NLS and inhibition of the APC/C interaction motifs are important for negative control of Cdh1 by Cdk1 phosphorylation, indicating that APC/C-Cdh1 is active in the nucleus.
This finding received further support by the characterization of the Cdc20-degron for APC/C-Cdh1-mediated proteolysis. The degron of Cdc20 comprises the N-terminal 80 residues of the activator and serves as an autonomous degradation domain for APC/C-Cdh1-specific in vivo degradation. In addition to a single D-box as APC/C recognition signal, an NLS was identified as an essential part of the degron. Indeed, localization of the Cdc20 degron in the nucleus is an important prerequisite for its APC/C-Cdh1-mediated proteolysis. Forced localization of the degron into different subcellular compartments revealed that the activity of APC/C-Cdh1 is confined to the nuclear compartment. Moreover, this work suggests that a Cdk site adjacent to the D-box may regulate the recognition of the Cdc20 degron by APC/C-Cdh1.
Furthermore, this study shows that the N-terminal domain of Cdc20 is sufficient to activate the APC/C. Interestingly, besides targeting Cdc20 for Cdh1-mediated degradation, the D-box was also found to play a role in activation of the APC/C. Deletion of the D-box only affected Cdc20 function when the ability of Cdc20 to bind the APC/C was already reduced, suggesting that the D-box may be involved in the fine-tuning of the APC/C-Cdc20 interaction.
Analysis of Cdc20-Cdh1 chimeras revealed that the N-terminal segments of the activators are interchangeable regulatory and APC/C activation domains, while the C-terminal WD40 domains determine the substrate specificities of the activators. A genetic screen identified residues within the WD40 domain of Cdh1 that contribute to the discrimination between Cdc20 and Cdh1 substrates and specifically affected the recognition of the Cdc20 substrate Pds1. This suggests that the activators contain individual binding sites in their WD40 domains, in addition to the conserved D- and KEN-box receptors, for selective binding of substrates.
Metadata last modified: 25 Nov 2020 15:39
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