Semi-automated extraction of stromal vascular fraction for autologous cell therapy

URN to cite this document: urn:nbn:de:bvb:355-epub-355932

Hanke, Alexander (2017) Semi-automated extraction of stromal vascular fraction for autologous cell therapy. PhD, Universität Regensburg.

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Date of publication of this fulltext: 28 Apr 2017 08:56

Abstract (English)

Abstract (English)

Introduction: The stem cell rich Stromal Vascular Fraction (SVF) can be obtained by enzymatic digestion with a collagenase followed by centrifugation from patients’ lipoaspirate or fat tissue. To date neither a standardized extraction method nor a generally accepted application procedure exists for common use on patient. A novel commercially available semi-automated device for the extraction of SVF promises sterility, consistent results and usability in the clinical routine. The aim of this work was to investigate the quantity and quality of the SVF obtained by a semi-automated process in comparison to an established manual laboratory method.
Material and Methods: SVF was extracted from lipoaspirate by a prototype of the semi-automated UNiStation (NeoGenesis, Seoul, Korea) as well as by hand preparation with common laboratory equipment. The SVF was measured by multi-parametric flow-cytometry (FACSCanto-II, BD Biosciences) following the lysis of the remaining erythrocytes. The primary interest was the total cell number (quantity) of the extracted cells. In addition, the quality of the SVFs was investigated using the stem cell marker CD34, the leucocyte marker CD45 and the marker CD271 for highly proliferative stem cells. Furthermore, the distribution of these markers, double positive cells and the stain index were investigated.
Results: Lipoaspirate obtained from six patients was processed with both the novel device (d) as the hand preparation using laboratory equipment (h), always resulting in a macroscopically visible SVF. However, there was a tendency of a fewer cell yield per gram of used lipoaspirate with the device (d: 1.1*105±1.1*105 vs. h: 2.0*105±1.7*105; p=0.06). Regarding the composition of the SVF, the percentage of CD34+ cells was significantly reduced with the device (d: 57.3±23.8% vs. h: 74.1±13.4%; p=0.02). On the contrary there was a tendency to a higher percentage of CD45+ leukocytes (d: 20.7±15.8% vs. h: 9.8±7.1%; p=0.07). The percentage of highly proliferative CD271+ cells was comparable for both methods (d: 13.4±11.6% vs. h: 12.9±9.6%; p=0.74). No significant difference was identified regarding the double positive cell fraction for CD34+/CD45+ (d: 0.5±0.6% vs. h: 0.3±0.2%; p=0.21) and CD34+/CD271+ (d: 1.9±2.3% vs. h: 2.4±2.0%; p=0.42). Double positive cells for CD45+/CD271+ were not detected in any sample. The stain index did not show a significant difference between the two extraction methods (p>0.12).
Discussion: The semi-automated system was able to provide considerable amounts of sterile SVF without requiring much space. The SVF extracted by the semi-automated process showed only little difference in its composition compared with the SVF obtained by the hand preparation. Taken together both methods showed comparable extraction results which are in accordance with the data from literature. This semi-automated system offers an opportunity to take research and application of the SVF one step further to the clinic.

Translation of the abstract (German)

Einleitung: Die stammzellreiche Stromal Vascular Fraction (SVF) kann aus Lipoaspirat oder Fettgewebe durch enzymatische Verdau und anschließender Zentrifugation gewonnen werden. Bisher hat sich jedoch weder ein einheitliches Extraktionsverfahren, noch eine gängige Methode zur Anwendung am Patienten durchgesetzt. Ein neues kommerziell erhältliches halbautomatisches System zur Herstellung von SVF verspricht Sterilität, konstante Ergebnisse und Anwendbarkeit im klinischen Alltag. Ziel dieser Arbeit war es die Menge und Qualität der SVF, welche mit diesem System gewonnen werden kann, mit einer etablierten manuellen Labormethode zu vergleichen.
Material und Methodik: Die SVF wurde aus Lipoaspirat sowohl mit einem Prototyp der halbautomatischen UNiStation (NeoGenesis, Seoul, Korea) als auch mittels einer etablierten manuellen Labormethode extrahiert. Nach Lyse der verbliebenen Erythrozyten in der SVF erfolgte eine Messung mittels multiparametrischer Durchflusszytometrie (FACSCanto-II, BD Biosciences). Von Interesse war vorrangig die (Quantität) Gesamtzellzahl des gewonnenen Materials. Zusätzlich wurde die Qualität der SVF anhand des Stammzellmarkers CD34, dem Leukozytenmarker CD45 und dem Marker CD271 für hochproliferative Stammzellen untersucht. Des Weiteren wurden die prozentuale Verteilung dieser Marker in der SVF, doppelt positive Zellen und der stain index ermittelt.
Ergebnisse: Aus Lipoaspirat von sechs Patienten wurde sowohl mit der Maschine (d für „device“) als auch der (manuellen) Labormethode (h für „hand preparation“) eine makroskopisch sichtbare SVF erzeugt. Mit der maschinellen Extraktion war die Zellausbeute pro ursprünglichem Gramm Lipoaspirat jedoch tendenziell geringer (d: 1.1*105±1.1*105 vs. h: 2.0*105±1.7*105; p=0.06). Bei der Zusammensetzung der SVF zeigte sich der Anteil an CD34+ Zellen nach maschineller Extraktion signifikant reduziert (d: 57.3±23.8% vs. h: 74.1±13.4%; p=0.02). Im Gegensatz dazu lag der Anteil an CD45+ Leukozyten tendenziell höher (d: 20.7±15.8% vs. h: 9.8±7.1%; p=0.07). Die Fraktion hochproliferativer CD271+ Zellen zeigte unabhängig von der Extraktionsmethode vergleichbarer Ergebnisse ohne signifikanten Unterschied (M: 13.4±11.6% vs. L: 12.9±9.6%; p=0.74). Es konnte kein Unterschied bzgl. des Anteils doppelt positiver Zellen für CD34+/CD45+ (d: 0.5±0.6% vs. h: 0.3±0.2%; p=0.21) sowie CD34+/CD271+ (d: 1.9±2.3% vs. h: 2.4±2.0%; p=0.42) festgestellt werden. CD45+/CD271+ doppelt positive Zellen konnten in keiner Probe nachgewiesen werden. Außerdem gab es keinen signifikanten Unterschied bezüglich des Stain Index (p>0.12).
Diskussion und Schlussfolgerung: Das halbautomatisierte System ermöglicht auf kleinstem Raum nennenswerte Mengen an SVF steril zu gewinnen. Diese SVF unterscheidet sich nur geringfügig in der Zusammensetzung gegenüber der manuellen SVF Extraktion. Insgesamt decken sich die Ergebnisse beider Methoden sehr gut mit den aus der Literatur bekannten Werten. Das halbautomatisierte System bietet die Möglichkeit, Forschung und Anwendung der SVF einen Schritt näher in die Klinik zu bringen.

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Item type:	Thesis of the University of Regensburg (PhD)
Date:	28 April 2017
Referee:	Prof. Dr. Dr. Lukas Prantl
Date of exam:	26 April 2017
Institutions:	Medicine > Lehrstuhl für Unfallchirurgie
Keywords:	MSC, SVF, hASCs, mesenchymal stem cell, stromal vascular fraction, human adipocyte-derived stem cells, adipose tissue, liposuction, autologous therapy, stem cell, CD34, CD45, CD271, CFU, colony forming unit, device, plastic surgery, reconstructive surgery, device, prototype, fat graft, kollagenase, cell culture, flow cytometry
Dewey Decimal Classification:	600 Technology > 610 Medical sciences Medicine
Status:	Published
Refereed:	Yes, this version has been refereed
Created at the University of Regensburg:	Yes
Item ID:	35593