| Lizenz: Creative Commons Namensnennung 4.0 International (16MB) |
- URN zum Zitieren dieses Dokuments:
- urn:nbn:de:bvb:355-epub-359076
- DOI zum Zitieren dieses Dokuments:
- 10.5283/epub.35907
| Dokumentenart: | Hochschulschrift der Universität Regensburg (Dissertation) |
|---|---|
| Open Access Art: | Primärpublikation |
| Datum: | 14 Juli 2017 |
| Begutachter (Erstgutachter): | Prof. Dr. Wolfgang Seufert |
| Tag der Prüfung: | 7 Juli 2017 |
| Institutionen: | Biologie und Vorklinische Medizin > Institut für Biochemie, Genetik und Mikrobiologie Biologie und Vorklinische Medizin > Institut für Biochemie, Genetik und Mikrobiologie > Cell Cycle Control Biologie und Vorklinische Medizin > Institut für Biochemie, Genetik und Mikrobiologie > Cell Cycle Control > Prof. Dr. Wolfgang Seufert |
| Stichwörter / Keywords: | cell cycle, Cdc14, Phosphatase, Net1, inhibition, truncation |
| Dewey-Dezimal-Klassifikation: | 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 570 Biowissenschaften, Biologie |
| Status: | Veröffentlicht |
| Begutachtet: | Ja, diese Version wurde begutachtet |
| An der Universität Regensburg entstanden: | Ja |
| Dokumenten-ID: | 35907 |
Zusammenfassung (Deutsch)
Die konservierte Phosphatase Cdc14, eine Vertreterin der Protein-Tyrosin-Phosphatasen-Superfamilie, spielt in der Bäckerhefe Saccharomyces cerevisiae eine essentielle Rolle während der Mitose und der Zytokinese. Die Phasen des Zellzyklus werden durch die oszillierende Aktivität der Zyklin-abhängigen Kinase Cdk1 gesteuert. In der Mitose ist diese Aktivität im Vergleich zur Interphase hoch. Für den ...
Zusammenfassung (Deutsch)
Die konservierte Phosphatase Cdc14, eine Vertreterin der Protein-Tyrosin-Phosphatasen-Superfamilie, spielt in der Bäckerhefe Saccharomyces cerevisiae eine essentielle Rolle während der Mitose und der Zytokinese. Die Phasen des Zellzyklus werden durch die oszillierende Aktivität der Zyklin-abhängigen Kinase Cdk1 gesteuert. In der Mitose ist diese Aktivität im Vergleich zur Interphase hoch. Für den Austritt aus der Mitose muss die Aktivität der mitotischen Zyklin-Cdk-Komplexe herunterreguliert werden. Diese wird durch gezielte Dephosphorylierungen von Cdk1-Substraten in der Anaphase durch den Hauptantagonisten Cdc14 inhibiert. Die biologische Aktivität von Cdc14 wird durch ihre subzelluläre Lokalisation kontrolliert: Bis zur Interphase wird Cdc14 im Nukleolus inaktiv gehalten. Diese Verankerung wird über ihren Inhibitor Net1 vermittelt. Die Bindung an Net1 findet durch eine Proteinwechselwirkung mit der katalytischen Domäne von Cdc14 statt. In dieser Arbeit konnte anhand co-immunologischer Bindungsstudien, Wachstumstests und in vitro-Analysen gezeigt werden, dass zwischen Binde- und Inhibitionsdomänen in N-terminalen Net1-Fragmenten differenziert werden kann.
In der Anaphase wird Cdc14 aus dem Nukleolus in den Zellkern und das Zytoplasma freigesetzt, um dort Zielproteine für den Austritt aus der Mitose zu dephosphorylieren. Diese Freisetzung von Net1 erfolgt über die zwei regulatorischen Netzwerke FEAR und MEN. Cdc14 besteht aus einer N terminalen katalytischen Domäne und aus einer variablen Domäne im C-terminalen Anteil. Letztere enthält eine Kernexportsequenz, eine kurze Tandem Repeat-Sequenz von bisher unbekannter Funktion, sowie eine Kernimportsequenz die durch MEN reguliert wird.
Aufgrund der hohen Konservierung in höheren Eukaryoten wurde in der Literatur im Besonderen die N-terminale katalytische Domäne intensiv untersucht. Zusätzliche Regulationsmechanismen der Lokalisation von Cdc14 im Zellzyklus werden jedoch über die variable Domäne erreicht. In dieser Arbeit kann gezeigt werden, dass die durch MEN kontrollierte Kernimportsequenz überflüssig für die Lokalisation und die Funktion von Cdc14 ist. So wies ein N-terminales Derivat der Phosphatase in Abwesenheit der Kernimportsequenz ein vollkommen typisches Lokalisationsmuster auf.
Ergänzend konnte in dieser Arbeit beschrieben werden, dass die variable Domäne zwar hinreichend ist, um den Kerntransport zu unterstützen, jedoch weitere Lokalisationsdomänen abseits der C terminalen Domäne vorliegen müssen.
Darüber hinaus konnte in dieser Arbeit erstmals gezeigt werden, dass Cdc14 ohne einen Teil der Tandem Repeat-Sequenz nicht mehr in der Lage ist, eine Deletion von CDC14 zu komplementieren, was auf eine essentielle Funktion dieses Motivs hinweist. Dieser Bereich in der C-terminalen Domäne konnte präzise eingegrenzt werden. In dieser Sequenz befinden sich ein Cdk1-Konsensusmotiv, sowie eine in anderen Hefen kurze konservierte Region. Zudem wurde festgestellt, dass diese Sequenz die Phosphatase-Aktivität in vitro unterstützt. Dieser Bereich wurde durch Lokalisationsstudien anhand bekannter Substrate von Cdc14 näher analysiert, was eine verlängerte Anaphasedauer und eine verminderte Phosphatasefunktion in vivo offenbarte.
Die Identifizierung einer die Phosphatasefunktion unterstützenden Sequenz in der variablen Domäne von Cdc14 könnte in Zukunft interessante Einblicke über weitere regulatorische Mechanismen von Cdc14 in S. cerevisiae in der Mitose bieten.
Übersetzung der Zusammenfassung (Englisch)
In the budding yeast Saccharomyces cerevisiae, the conserved phosphatase Cdc14, a member of the protein tyrosine phosphatase superfamily, fulfills an essential function in mitosis and cytokinesis. The cell cycle is determined by the oscillatory activity of the cyclin-dependent kinase Cdk1. This activity is high during mitosis, compared to interphase. For the exit from mitotis the activity of ...
Übersetzung der Zusammenfassung (Englisch)
In the budding yeast Saccharomyces cerevisiae, the conserved phosphatase Cdc14, a member of the protein tyrosine phosphatase superfamily, fulfills an essential function in mitosis and cytokinesis. The cell cycle is determined by the oscillatory activity of the cyclin-dependent kinase Cdk1. This activity is high during mitosis, compared to interphase. For the exit from mitotis the activity of mitotic cyclin-Cdk-complexes has to be downregulated. In anaphase this is mediated by dephosphorylation of Cdk1 substrates by its major antagonist Cdc14.
The biological activity of Cdc14 is controlled by its subcellular localization: During interphase Cdc14 is sequestered in the nucleolus. This anchoring is obtained by its inhibitor Net1. Binding to Net1 is mediated via direct protein interaction with the catalytic domain of Cdc14. This work revealed through co-immunological binding, growth assays and in vitro tests, there can be differentiated between binding and inhibitory domains within N-terminal Net1 fragments.
At anaphase onset Cdc14 is set free from the nucleolus, where it disperses over the nucleus and cytoplasm dephosphorylating target proteins necessary for exit from mitosis. This release from Net1 is controlled by two signalling pathways called FEAR and MEN. Cdc14 consists of a N-terminal catalytic domain and a variable domain in the C-terminal portion. The latter contains a nuclear export sequence, a short tandem repeat sequence of unknown funktion and nuclear localization sequence controlled by MEN.
Due to its strong conservation among higher eucaryotes, literature dominantly focused on the N-terminal catalytic domain. Further cell cycle control of Cdc14 localization is obtained by its variable part. This work revealed that the MEN-controlled nuclear localization sequence is dispensable for localization and function of Cdc14. Hence, a N-terminal truncation of the phosphatase without the nuclear localization sequence presented a typical localization pattern.
In addition, this work reports, even though the variable domain is sufficient to support nuclear shuttling, other regulatory mechanisms for its localization in absence of the C-terminal domain have to be existent.
In contrast, this work showed that a truncation mutant lacking a part of the tandem repeat sequence of Cdc14 was no longer sufficient to complement a deletion of CDC14 pointing to an essential role of this motif. The essential property of this C-terminal portion was narrowed down. Within this region resides a Cdk1 recognition motif and a short conserved sequence along yeasts. Moreover it was discovered this region was crucial to support phosphatase activity in vitro. It was further analyzed by localization studies with known Cdc14 substrates, which exhibited an extended anaphase and a decreased phosphatase activity in vivo during cell cycle.
Identification of a phosphatase activity stimulating feature of the variable domain of Cdc14 might reveal interesting insights of additional mechanisms of Cdc14 in S. cerevisiae during mitosis in future.
Metadaten zuletzt geändert: 25 Nov 2020 21:05
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