| License: Creative Commons Attribution 4.0 (161MB) |
- URN to cite this document:
- urn:nbn:de:bvb:355-epub-360350
- DOI to cite this document:
- 10.5283/epub.36035
| Item type: | Thesis of the University of Regensburg (PhD) |
|---|---|
| Date: | 12 July 2018 |
| Referee: | Prof. Dr. Reinhard Sterner and Prof. Dr. Herbert Tschochner and Prof. Dr. Christine Ziegler |
| Date of exam: | 6 July 2017 |
| Institutions: | Biology, Preclinical Medicine > Institut für Biophysik und physikalische Biochemie > Prof. Dr. Reinhard Sterner |
| Keywords: | Funktionsaufklärung; Nukleotidpyrophosphatase; SOS-Antwort; DNA-Bindung |
| Dewey Decimal Classification: | 500 Science > 500 Natural sciences & mathematics 500 Science > 570 Life sciences |
| Status: | Published |
| Refereed: | Yes, this version has been refereed |
| Created at the University of Regensburg: | Yes |
| Item ID: | 36035 |
Abstract (German)
Im Zuge der Evolution sind viele neue Proteinfunktionen durch Genduplikation und Diversifikation aus gemeinsamen Vorläufern entstanden. Ein gutes Beispiel hierfür ist die im Rahmen dieser Arbeit untersuchte TrpD2-Proteinfamilie, die homolog zu den Anthranilat-Phosphoribosyltransferasen (TrpD) und Nukleosidphosphorylasen der Klasse II (NP-II) ist. Neben einer gewissen Übereinstimmung auf ...
Abstract (German)
Im Zuge der Evolution sind viele neue Proteinfunktionen durch Genduplikation und Diversifikation aus gemeinsamen Vorläufern entstanden. Ein gutes Beispiel hierfür ist die im Rahmen dieser Arbeit untersuchte TrpD2-Proteinfamilie, die homolog zu den Anthranilat-Phosphoribosyltransferasen (TrpD) und Nukleosidphosphorylasen der Klasse II (NP-II) ist. Neben einer gewissen Übereinstimmung auf Sequenzebene wird die evolutionäre Beziehung der TrpD-, TrpD2- und NP-II-Proteine vor allem anhand ihres gemeinsamen Faltungstyps erkenntlich. Trotz dieser Gemeinsamkeiten katalysieren die Vertreter der drei Proteinfamilien unterschiedliche Reaktionen. So sind die TrpD-Enzyme an der Tryptophan-Biosynthese beteiligt, wohingegen die NP-II-Enzyme eine wichtige Rolle im pyrimidine salvage pathway spielen. Die biologische Funktion der TrpD2-Proteine hingegen war zu Beginn dieser Arbeit noch unbekannt. Jedoch deuteten die bereits vorhandenen Daten darauf hin, dass TrpD2 eine Rolle im Kontext der Behebung von DNA-Schäden spielen könnte. Basierend auf dieser Annahme wurden weiterführende Hypothesen bezüglich der Funktion der TrpD2-Proteine aufgestellt, die im Verlauf dieser Arbeit am Beispiel des TrpD2-Vertreters aus Escherichia coli, YbiB, überprüft wurden.
Im Hinblick auf eine mögliche Rolle als DNA-Reparaturenzym wurde die bereits beschriebene Interaktion von YbiB mit Nukleinsäuren detaillierter charakterisiert, wobei sowohl strukturell intakte, als auch modifizierte Nukleinsäuren in den Bindungsexperimenten eingesetzt wurden. Die Ergebnisse von electrophoretic mobility shift assays (EMSAs) und von fluoreszenzspektroskopischen Untersuchungen zeigten, dass YbiB mit einer hohen Affinität (20 – 100 nM) sowohl einzelsträngige, als auch doppelsträngige Nukleinsäuren vergleichbar gut und ohne Sequenzspezifität bindet. Die Interaktion wird dabei vermutlich über elektrostatische Wechselwirkungen zwischen positiv geladenen Aminosäureseitenketten des Proteins und dem negativ geladenen Phosphatrückgrat der Nukleinsäure vermittelt. Dies führt im Fall intakter Nukleinsäuren zur Ausbildung eines transienten Komplexes, wobei die Bindung mehrerer YbiB-Proteine an ein und dieselbe Nukleinsäure kooperativ erfolgt (Hill-Koeffizient n >1.5). Des Weiteren wurde beobachtet, dass die Anwesenheit einer abasischen Position in einem doppelsträngigen DNA-Fragment das Bindeverhalten des YbiB-Proteins derart beeinflusst, dass dieses nicht mehr durch einen hyperbolen Kurvenverlauf beschrieben werden konnte. Die bisher gewonnenen experimentellen Daten können jedoch diesen Befund nicht vollständig erklären, sie deuten weder auf eine signifikant höhere Affinität noch auf eine andere Konformation der YbiB-Tertiärstruktur bei Bindung an DNA mit abasischer Position hin. Es konnte jedoch mittels Förster-Resonanzenergietransfer (FRET)-Experimenten beobachtet werden, dass sich generell im Zuge einer Nukleinsäurebindung die Proteinkonformation im Bereich der vorhergesagten Nukleinsäurebindetasche signifikant verändert. Um die Struktur eines YbiB-DNA-Komplexes mittels Röntgenkristallographie aufzuklären, wurden aufgrund des transienten Bindungsverhaltens das YbiB-Protein und die Nukleinsäure nach erfolgter Komplexbildung miteinander kovalent verknüpft. Dies wurde durch die nichtnatürliche Aminosäure para-Benzoyl-L-phenylalanin ermöglicht, welche in die YbiB-Struktur an einer geeigneten Position eingefügt wurde. Zwar konnten ausreichende Mengen des kovalent verknüpften Komplexes hergestellt werden, es gelang jedoch nicht, Kristalle des Komplexes zu züchten. Zumindest konnte jedoch eine gut aufgelöste (1.9 Å) und vor allem vollständige YbiB-Apostruktur einschließlich einer bisher nicht aufgelösten flexiblen Schlaufe gelöst werden.
Unter der Annahme, dass es sich bei YbiB um ein neuartiges DNA-Reparaturenzym handeln könnte, wurde untersucht, ob YbiB eine DNA-Glykosylaseaktivität besitzt. Zu diesem Zweck wurden unterschiedlich geschädigte Nukleinsäuren in vitro hergestellt, diese zusammen mit YbiB bzw. Positivkontrollen inkubiert und anschließend die entstandenen Reaktionsprodukte analysiert. Eine DNA-Glykosylaseaktivität von YbiB gegenüber den in dieser Arbeit verwendeten DNA-Schäden konnte dabei nicht festgestellt werden, was jedoch eine DNA-Glykosylaseaktivität gegenüber noch nicht getesteten Schäden nicht gänzlich ausschließt.
Alternativ zur DNA-Glykosylase-Hypothese wurde zudem überprüft, ob YbiB gegenüber geschädigten Nukleosiden und Nukleotiden eine Nukleosidphosphorylaseaktivität aufweist. So wurden zunächst verschiedene Nukleoside und Nukleotide oxidativ geschädigt, anschließend mit YbiB inkubiert und die Reaktionsprodukte analysiert. Diese in vitro-Experimente zeigten zwar keine Nukleosidphosphorylaseaktivität von YbiB, stattdessen konnte aber eine Nukleotidpyrophosphatase-Aktivität gegenüber 8 Oxo-dGTP als Substrat identifiziert werden. 8 Oxo dGTP kann im Verlauf der DNA-Replikation ins Genom integriert werden und dort zu Punktmutationen führen. Zwar besitzt E. coli mit der Nudix-Hydrolase MutT bereits ein Enzym, das 8 Oxo-dGTP eliminiert, jedoch kann die Expression von MutT im Gegensatz zu YbiB nicht im Rahmen der SOS-Antwort auf massive DNA-Schäden angehoben werden. Weiterhin ergab die Charakterisierung der Magnesium-abhängigen Nukleotidpyrophosphatase-Aktivität von YbiB eine wesentlich striktere Substratspezifität als bei MutT. So wurde außer 8 Oxo-dGTP und 8 Oxo-GTP keines der anderen getesteten Nukleosidtriphosphate, insbesondere keines der intakten Nukleosidtriphosphate wie bei MutT, dephosphoryliert. Für das Substrat 8-Oxo-dGTP konnte ein KM-Wert von 2.9 µM, ein kcat-Wert von 3.7•10-3 min-1 und eine katalytische Effizienz von 21.7 M-1 s-1 bestimmt werden. Trotz der niedrigen katalytischen Effizienz konnte in vivo gezeigt werden, dass sich durch die Expression eines plasmidkodierten YbiB-Proteins die Spontanmutationsfrequenz in einem E. coli ΔmutT-Stamm signifikant verringert. Es konnte jedoch bisher nicht zweifelsfrei geklärt werden, ob es sich bei 8-Oxo-dGTP und 8 Oxo-GTP um die einzigen beiden Substrate von YbiB handelt, weshalb weitere geschädigte Nukleosidtriphosphate als eventuell besser umsetzbare Substrate getestet werden müssen.
Translation of the abstract (English)
In the course of evolution, gene duplication and diversification led to the emergence of various novel protein functions from common predecessors. This is also true for the TrpD2 protein family, which is homologous to the anthranilate phosphoribosyltransferases (TrpD) and the class II nucleoside phosphorylases (NP-II). In addition to certain sequence similarities the relation of the TrpD, TrpD2 ...
Translation of the abstract (English)
In the course of evolution, gene duplication and diversification led to the emergence of various novel protein functions from common predecessors. This is also true for the TrpD2 protein family, which is homologous to the anthranilate phosphoribosyltransferases (TrpD) and the class II nucleoside phosphorylases (NP-II). In addition to certain sequence similarities the relation of the TrpD, TrpD2 and NP-II proteins is particularly reflected by their common protein fold. Despite their similarities, the members of these three protein families catalyze different reactions. Thus, the TrpD enzymes are part of the tryptophan biosynthesis pathway, whereas the NP-II enzymes are involved in the pyrimidine salvage pathway. In contrast, the biological function of the TrpD2 proteins was not known at the beginning of this work. However, the already available data indicated that TrpD2 presumably plays a role in the context of DNA repair. Based on this assumption, several hypotheses concerning the function of the TrpD2 proteins were put forward and subsequently tested in the course of this work by the examination of the TrpD2 protein form Escherichia coli YbiB.
Regarding its putative function as a DNA repair enzyme, the previously described interaction with nucleic acids was further characterized in detail and to this end, the binding of YbiB to unimpaired and modified nucleic acids was analyzed. The results of electrophoretic mobility shift assays (EMSAs) and fluorescence spectroscopic measurements showed, that YbiB binds with high affinity (20 – 100 nM) to single and double stranded nucleic acids in a sequence independent manner. The binding is presumably mediated by electrostatic interactions between positively charged amino acid sidechains and the negatively charged backbone of the nucleic acid. Although this binding behavior leads to the formation of transient YbiB-DNA complexes, the binding of multiple YbiB proteins to the same nucleic acid takes place in a cooperative manner (Hill coefficient n > 1.5). In addition, the presence of an abasic site within double stranded DNA influences the binding behavior of the YbiB protein in a way that the binding data could no longer be described by a hyperbolic function. Based on the current data, this observation can neither be explained by a significant increase in affinity nor by conformational changes of the YbiB tertiary structure induced by the binding of a DNA containing an abasic site. However, the results of some Förster resonance energy transfer (FRET) experiments showed that the binding of nucleic acids generally changes the conformation of the putative nucleic acid binding site. In addition, the structure of a YbiB-DNA complex should be solved by X-ray crystallography and therefore, in consideration of the transient binding behavior, the YbiB protein was covalently linked to the nucleic acid after the complex had been formed. The link was established by the unnatural amino acid para-benzoyl-L-phenylalanine (pBPA), which was incorporated at a suitable position within the YbiB structure. The covalently linked complex could be prepared in sufficient amounts, but in the end it was not possible to obtain a crystal of the complex. At least a highly resoluted (1.9 Å) and, more importantly, a complete YbiB apo structure, which even includes a previously unresolved flexible loop, was solved.
Based on the assumption, that YbiB could be a novel DNA repair enzyme, it was examined, whether YbiB posseses a DNA glycosylase activity. Therefore, in vitro damaged nucleic acids were incubated together with YbiB or a positive control and the reaction products were analyzed. A DNA glycosylase activity against any of the damaged nucleic acids used in this work was not observed. However, many DNA damages remain that need to be tested and therefore, the hypothesis of YbiB being a DNA glycosylase cannot be completely excluded.
In addition, it was also examined, whether YbiB posseses a nucleoside phosphorylase activity against damaged nucleosides and nucleotides. Therefore, various nucleosides and nucleotides were damaged by oxidation and incubated with YbiB and the resulting reaction products were analyzed. Although no nucleoside phosphorylase activity was observed in these in vitro experiments, a nucleotide pyrophosphatase activity against the substrate 8-Oxo-dGTP could be identified. In the course of DNA replication, 8 Oxo-dGTP can be incorporated into the genome and give rise to point mutations. Although E. coli already posseses the Nudix hydrolase MutT to eliminate 8 Oxo-dGTP, the expression of MutT, cannot be induced by the SOS response system on severe DNA damage like YbiB. Furthermore, the characterization of the magnesium dependent nucleotide pyrophosphatase actitivity revealed, that YbiB has a quite narrow substrate range compared to the MutT protein. Besides 8 Oxo-dGTP and 8 Oxo-GTP, none of the other tested nucleoside triphosphates was dephosphorylated, most notably none of the unimpaired nucleoside triphosphates as in the case for MutT. For the substrate 8 Oxo-dGTP a KM value of 2.9 µM, a kcat value of 3.7•10-3 min-1 and a catalytic efficiency of 21.7 M-1 s-1 was determined. Despite the low catalytic efficiency, it was shown in vivo that the expression of a plasmid encoded YbiB protein significantly decreases the spontaneous mutation frequency of an E. coli ΔmutT strain. Nevertheless, it was not possible to determine whether 8-Oxo-dGTP and 8 Oxo-GTP are indeed the only substrates of the YbiB protein. Therefore, further nucleoside triphosphates need to be tested in the future to define the substrate range of the YbiB protein
Metadata last modified: 25 Nov 2020 21:04
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