| License: Creative Commons Attribution No Derivatives 4.0 PDF - Accepted Version (9MB) |
- URN to cite this document:
- urn:nbn:de:bvb:355-epub-360415
- DOI to cite this document:
- 10.5283/epub.36041
| Item type: | Thesis of the University of Regensburg (PhD) |
|---|---|
| Open Access Type: | Primary Publication |
| Date: | 13 July 2018 |
| Referee: | Prof. Dr. Frank Sprenger and Prof Dr. Dr. Michael Krahn and Prof. Dr. Wolfgang Seufert |
| Date of exam: | 13 July 2017 |
| Institutions: | Biology, Preclinical Medicine > Institut für Biochemie, Genetik und Mikrobiologie Biology, Preclinical Medicine > Institut für Biochemie, Genetik und Mikrobiologie > Cell Cycle Control Biology, Preclinical Medicine > Institut für Biochemie, Genetik und Mikrobiologie > Cell Cycle Control > Prof. Dr. Frank Sprenger |
| Keywords: | cell cycle; mitotic entry; APC/C; SCF; Rca1; Dap |
| Dewey Decimal Classification: | 500 Science > 500 Natural sciences & mathematics 500 Science > 570 Life sciences |
| Status: | Published |
| Refereed: | Yes, this version has been refereed |
| Created at the University of Regensburg: | Yes |
| Item ID: | 36041 |
Abstract (English)
The Anaphase-Promoting Complex/Cyclosome (APC/C) drives degradation of a large variety of mitotic cell cycle regulators. Therefore, tight regulation of APC/C activity plays a central role in proper cell cycle progression. Suppression of APC/C activity during G2-phase is crucial for entry into mitosis. This is achieved 1) by Cdk-dependent phosphorylation of the APC/C activator subunit Fzr, which ...
Abstract (English)
The Anaphase-Promoting Complex/Cyclosome (APC/C) drives degradation of a large variety of mitotic cell cycle regulators. Therefore, tight regulation of APC/C activity plays a central role in proper cell cycle progression. Suppression of APC/C activity during G2-phase is crucial for entry into mitosis. This is achieved 1) by Cdk-dependent phosphorylation of the APC/C activator subunit Fzr, which renders Fzr unable to interact with the APC/C, and 2) by direct inhibition of APC/C-Fzr by Regulator of Cyclin A1 (Rca1). Previous studies suggest that not only the C-terminal part, but also the central localized F-box in Rca1 is fundamental for APC/C-Fzr inhibition. F-box proteins usually recruit substrates to SCF complexes, causing their polyubiquitination and subsequent degradation. To identify such substrates, an Rca1 precipitate from S2R+ cells was analyzed by mass spectrometry. Rca1 was found in complex with SCF components and other cell cycle regulators including Dacapo (Dap) and Skp2. Rca1 binds polyubiquitinated substrates in an F-box dependent manner in vivo giving evidence for a functional SCF-Rca1 complex. To analyze, whether SCF-Rca1 affects the protein stability of Dap and Skp2, a method for the stability analysis of GFP-labeled proteins during cell cycle progression of S2R+ cells was established. Dap stability was analyzed using a cell cycle inactive GFP-tagged version of Dap that lacks destabilization by CRL4-Cdt2 during S-phase (GFP-Dap-dCDI-dPIPa). Downregulation of Rca1 activity by RNAi resulted in upregulation of GFP-Dap-dCDI-dPIPa protein levels. Conversely, overexpression of Rca1 stimulated degradation of GFP-Dap-dCDI-dPIPa in an
F-box dependent manner. Overexpression of CycE enhanced the interaction between Rca1 and Dap-dCDI-dPIPa, and further destabilized GFP-Dap-dCDI-dPIPa. These studies indicate that SCF-Rca1 functions synergistically with CycE/Cdk2 to target Dap for degradation. Two candidate Cdk phosphorylation sites in Dap, S205 and S214, were mutated but these mutations did neither affect the stability nor did they impair the interaction with Rca1. Interaction analyses with different truncated Rca1 and Dap constructs have revealed that the N-terminal part of Dap and the central region in Rca1 are required for their interaction. Loss of Rca1 binding by deletion of N-terminal residues in GFP-Dap-dCDI-dPIPa resulted in its complete stabilization. Flow cytometric based in vivo APC/C-Fzr activity assays in S2R+ cells were used to analyze the functional interaction between SCF-Rca1 and Dap. Loss of the F-box reduced APC/C-Fzr inhibition. However, this defect in APC/C-Fzr inhibition was suppressed by RNAi-mediated downregulation of Dap activity. Taken together, these studies provide a model, in which SCF-Rca1 targets Dap for degradation to release CycE/Cdk2 activity for APC/C-Fzr inhibition. To analyze the biochemical inhibition of APC/C-Fzr by Rca1 in more detail, an in vitro APC/C-Fzr ubiquitination assay was further developed. Experiments in the past failed to purify active Drosophila APC/C-Fzr from transgenic embryos. Therefore, a stable S2R+ cell line expressing a GFP-tagged APC/C component, Cdc16-MYC-TEV-GFP, was established. In addition, Fzr was in vitro translated in reticulocyte lysate and purified from baculovirus-infected SF-21 cells. APC/C-Fzr-dependent ubiquitination activity was detected to some extend by using Cdc16 precipitate treated with in vitro translated Fzr.
Translation of the abstract (German)
Der Anaphase-Promoting Complex/Cyclosome (APC/C) vermittelt den Abbau einer Vielzahl an mitotischen Zellzyklus-regulatorischen Proteinen und eine strikte Regulation der APC/C Aktivität spielt eine zentrale Rolle im Zellzyklus. Für den Eintritt in die Mitose ist es wichtig, den APC/C in der G2-Phase inaktiv zu halten; dies geschieht 1) durch Cdk-abhängige Phosphorylierung der APC/C-aktivierenden ...
Translation of the abstract (German)
Der Anaphase-Promoting Complex/Cyclosome (APC/C) vermittelt den Abbau einer Vielzahl an mitotischen Zellzyklus-regulatorischen Proteinen und eine strikte Regulation der APC/C Aktivität spielt eine zentrale Rolle im Zellzyklus. Für den Eintritt in die Mitose ist es wichtig, den APC/C in der G2-Phase inaktiv zu halten; dies geschieht 1) durch Cdk-abhängige Phosphorylierung der APC/C-aktivierenden Untereinheit Fzr, wodurch Fzr nicht mehr mit dem APC/C interagieren kann, und 2) durch direkte Inhibition von APC/C-Fzr mittels Regulator of Cyclin A1 (Rca1). Vorangegangene Studien lassen vermuten, dass neben dem C-terminalen Teil auch die zentral lokalisierte F-box in Rca1 wichtig für die APC/C-Fzr Inhibition ist. F-box Proteine rekrutieren normalerweise Substrate zu SCF Komplexen, was zu deren Polyubiquitinierung und anschließendem Abbau führt. Um solche Substrate zu identifizieren, wurde ein Rca1 Präzipitat von S2R+ Zellen mittels Massenspektrometrie analysiert. Rca1 wurde in Komplex mit SCF Komponenten und anderen Zellzyklus-regulatorischen Proteinen wie Dap und Skp2 gefunden. Rca1 bindet in vivo F-box abhängig polyubiquitinierte Substrate, was auf einen funktionalen SCF-Rca1 Komplex hinweist. Um zu analysieren, ob SCF-Rca1 die Proteinstabilität von Dap und Skp2 beeinflusst, wurde eine Methode für die Stabilitätsanalyse von GFP-gebundenen Proteinen während des Verlauf des Zellzyklus von S2R+ Zellen etabliert. Die Dap Stabilität wurde analysiert, indem eine Zellzyklus-inaktive GFP-getaggte Version von Dap verwendet wurde, welche nicht mehr während der S-Phase durch CRL4-Cdt2 destabilisiert wird (GFP-Dap-dCDI-dPIPa). Herabregulation der Rca1 Aktivität mittels RNAi führte zu einer Stabilisierung von GFP-Dap-dCDI-dPIPa. Im Gegensatz dazu, stimulierte die Überexpression von Rca1 F-box abhängig den Abbau von GFP-Dap-dCDI-dPIPa. Überexpression von CycE verstärkte die Interaktion zwischen Rca1 und Dap-dCDI-dPIPa und führte zu einer weiteren Destabilisierung von GFP-Dap-dCDI-dPIPa. Dies zeigt, dass SCF-Rca1 synergistisch mit CycE/Cdk2 agiert um den Abbau von Dap zu vermitteln. Zwei potentielle Cdk Phosphorylierungsstellen in Dap, S205 und S214, wurden mutiert, jedoch beeinflussten diese Mutationen weder die Stabilität, noch störten sie die Interaktion mit Rca1. Interaktionsanalysen mit verkürzten Rca1 und Dap Konstrukten zeigten, dass der N-terminale Teil von Dap und die zentrale Region in Rca1 für deren Interaktion benötigt werden. Solche N-terminal verkürzten Dap-Konstrukte zeigten auch eine starke Stabilisierung von GFP-Dap-dCDI-dPIPa. Durchflusszytometrie-basierte in vivo APC/C-Fzr Aktivitäts-Assays in S2R+ Zellen wurden verwendet, um die funktionale Interaktion zwischen SCF-Rca1 und Dap zu analysieren. Ein Verlust der F-box in Rca1 reduzierte dessen APC/C-Fzr-Inhibition. Durch gleichzeitige RNAi-vermittelte Herabregulation von Dap wurde die APC/C-Inhibition zum Teil wiederhergestellt. Zusammengefasst kann aus diesen Studien ein Modell vorgeschlagen werden, in dem Rca1 in einem SCF-Komplex agiert, Dap als Substrat bindet und für den Abbau markiert. Dadurch kann CycE/Cdk2 Aktivität freigesetzt werden, was zur Phosphorylierung von Fzr führt und somit dessen Interaktion mit dem APC/C unterbindet. Um die Inhibition des APC/C durch Rca1 biochemisch zu untersuchen, wurde ein in vitro APC/C-Fzr Ubiquitinylierungsassay weiterentwickelt. Frühere Experimente, den Drosophila APC/Fzr aus transgenen Embryos zu isolieren schlugen fehl. Aus diesem Grund wurde eine stabile Zelllinie, die die GFP-getaggte APC/C Komponente Cdc16-MYC-TEV-GFP exprimiert, etabliert. Zusätzlich wurde Fzr in Retikulozytenlysat in vitro translatiert und von Baculovirus-infizierten SF-21 Zellen aufgereinigt. APC/C-Fzr-abhängige Ubiquitinylierungsaktivität wurde zum gewissen Ausmaß detektiert, wenn ein mit in vitro translatierten Fzr behandeltes Cdc16 Präzipitat eingesetzt wurde.
Metadata last modified: 25 Nov 2020 21:03
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