| License: Creative Commons Attribution No Derivatives 4.0 (9MB) |
- URN to cite this document:
- urn:nbn:de:bvb:355-epub-360465
- DOI to cite this document:
- 10.5283/epub.36046
| Item type: | Thesis of the University of Regensburg (PhD) |
|---|---|
| Date: | 28 August 2017 |
| Referee: | Prof. Dr. Achim Göpferich |
| Date of exam: | 7 July 2017 |
| Institutions: | Chemistry and Pharmacy > Institute of Pharmacy > Pharmaceutical Technology (Prof. Göpferich) |
| Keywords: | Rabiesvirus-Glykopeptide; ELSD; Maleimide; Blood-brain barrier; CNS; Liposomes |
| Dewey Decimal Classification: | 500 Science > 500 Natural sciences & mathematics 600 Technology > 615 Pharmacy |
| Status: | Published |
| Refereed: | Yes, this version has been refereed |
| Created at the University of Regensburg: | Yes |
| Item ID: | 36046 |
Abstract (English)
The blood-brain barrier (BBB) is an extremely selective barrier that prevents undesired entry of xenobiotics and noxae into central nervous system (CNS). While essential for many physiological processes, this function is a major drawback in brain drug delivery. The fact that viruses are able to pass the BBB accounts for why research tries to mimic their structure to enable the targeted delivery ...
Abstract (English)
The blood-brain barrier (BBB) is an extremely selective barrier that prevents undesired entry of xenobiotics and noxae into central nervous system (CNS). While essential for many physiological processes, this function is a major drawback in brain drug delivery. The fact that viruses are able to pass the BBB accounts for why research tries to mimic their structure to enable the targeted delivery of drugs into the brain. By doing so, uptake-relevant virus peptide sequences are coupled to the surface of nanoparticulate systems. The fate of virus peptide functionalized drug delivery systems (DDS) is an exciting focal point. Despite the immobilization of virus-related uptake information on the surface of the DDS, it is questionable whether such functionalized DDS follow the fate of the virus into the central nervous system (CNS). The rabies virus glycopeptide (RVG), an external peptide sequence derived from rabies virus, is said to have a CNS tropism. Therefore, RVG is widely used as ligand for CNS targeting strategies. However, its use as targeting ligand on DDS requires the modification of the RVG peptide sequence. Furthermore, the DDS itself has certain characteristics that may differ from the original rabies virus. The comparison of the rabies virus with RVG- functionalized DDS with respect to peptide modifications and physicochemical properties allows an invaluable insight into BBB-targeting strategies (chapter 1).
However, a delivery to the brain is not only a matter of decorating nanoparticulate systems with specific peptide sequences. The knowledge about tissue-specific requirements of the BBB together with cutting-edge manufacturing techniques allow for the preparation of tailor-made nanoparticulate systems with respect to size, surface charge and BBB-penetrating molecules with enhanced brain uptake. Liposomes were selected as promising candidates for BBB delivery. By selecting various phospholipids and using a solvent-injection technique, several liposome formulations were prepared to assess the impact of size, surface charge, PEG density and the usage of the brain specific polyunsaturated fatty acid docosahexaenic acid (DHA) on the cellular binding of brain endothelial cells (chapter 3).
To our surprise, the analytical characterization of these elaborate formulations is often overlooked. Although, there are no boundaries set with regard to formulation development of functionalized liposomes, the analytical characterization of such DDS often lacks the use of recent analytical techniques such as HPLC. This is a drawback as the manufacturing of functionalized liposomes is a multi-step process, which requires the analytical tracking of functionalized phospholipids during manufacturing. Therefore, an HPLC method using evaporative light scattering detection (ELSD) was developed to simultaneously determine all
compounds of a PEG containing liposome formulation. The presented method emphasized HPLC analysis as a powerful technique for the tracking of functionalized phospholipids during manufacturing. Furthermore, the developed HPLC method allowed the detection of degradation products (chapter 4).
The functionalization of a liposome requires the use of phospholipids carrying reactive groups for the covalent coupling of targeting ligands such as virus peptide sequences. The reactivity of the functional group is hence a prerequisite for the successful binding of the targeting ligand. Another important factor is that functionalization strategies of liposomes often demand multiple preparation steps, which may result in delay of the final reaction. This is especially critical for functional groups, which suffer from activity loss during this process. A prominent example is the maleimide functionality, which is prone to activity loss due to hydrolysis during manufacturing. By using an indirect Ellman’s assay, two common preparation methods for functionalized liposomes, namely pre- and post-insertion method, were analysed with regard to maleimide stability. The severe impact on maleimide activity was shown with 63% active maleimide groups for the pre-insertion method and 76% active maleimide groups for the post- insertion method (chapter 5).
Finally, brain endothelial cells were used to establish a cellular binding model for BBB-specific liposomes. The physiology of the BBB necessitate specific requirements with regard to size, surface charge or the use of brain-specific lipids for liposomes. bEnd.3 cells were used to assess such requirements with respect to physicochemical properties of liposomes. A positive charge was identified as an important key characteristic for BBB-specific liposomes, while size, PEG density and the use of the brain-specific polyunsaturated fatty acid DHA had no impact on the cellular binding of bEnd.3 cells (chapter 6).
Conclusion
On the whole, the presented work addressed neglected points of BBB-targeted delivery. The direct confrontation of RVG-functionalized DDS with rabies virus clearly revealed the impact of physicochemical properties on the native fate into the CNS. This unveils the common assumption of an exclusive uptake due to receptor-ligand interactions and emphasizes the relevance of the tracking of virus-functionalized DDS under the perspective of a combined virus-peptide and DDS related uptake strategy. Besides the deep dive into virus-related CNS targeting strategies, the missing quantitative characterization of such formulations turned out to be a weak point. Analytical methods need to be established considering how sophisticated these formulations are and how complex their manufacturing is.
Translation of the abstract (German)
Die Blut-Hirn-Schranke (BHS) ist eine selektive Barriere, die das unerwünschte Eindringen von Xenobiotika und Noxen in das zentrale Nervensystem (ZNS) verhindert. Während die Funktionalität der Blut-Hirn-Schranke für viele physiologische Vorgänge essenziell ist, stellt diese Barriere einen großen Nachteil im Hinblick auf die Passage von Wirkstoffen in das ZNS dar. Die Tatsache, dass Viren in der ...
Translation of the abstract (German)
Die Blut-Hirn-Schranke (BHS) ist eine selektive Barriere, die das unerwünschte Eindringen von Xenobiotika und Noxen in das zentrale Nervensystem (ZNS) verhindert. Während die Funktionalität der Blut-Hirn-Schranke für viele physiologische Vorgänge essenziell ist, stellt diese Barriere einen großen Nachteil im Hinblick auf die Passage von Wirkstoffen in das ZNS dar. Die Tatsache, dass Viren in der Lage sind die BHS zu passieren, ist der Grund dafür, weshalb die Forschung versucht, ihre Oberflächenstrukturen nachzuahmen und somit eine gezielte Wirkstoffabgabe zu ermöglichen. Dabei werden für die Aufnahme relevante Viruspeptidsequenzen an die Oberfläche von nanopartikulären Systemen gebunden. Trotz der Immobilisierung von virusbezogenen Aufnahmeinformationen an der Oberfläche der Wirkstoffabgabesysteme (DDS, engl. Drug Delivery Systems) ist es fraglich, ob solche funktionalisierten DDS den Aufnahmeweg des Virus in das ZNS folgen. Ein populäres Beispiel ist hierbei das Rabiesvirus-Glykopeptid (RVG), welches sich auf der Oberfläche des Tollwutvirus befindet und einen ZNS-Tropismus haben soll. Die Funktionalisierung an die Oberfläche von DDS erfordert die Modifikation der RVG-Sequenz. Darüber hinaus besitzt das DDS selbst bestimmte Eigenschaften, die sich von den ursprünglichen physikochemischen Eigenschaften des Tollwutvirus unterscheiden. Der Vergleich des Tollwutvirus mit RVG-funktionalisierten DDS hinsichtlich der Peptidmodifikationen und physiochemischen Eigenschaften gewährt einen wertvollen Einblick in ZNS Targeting Strategien.
Der zielgerichtete Transport von DDS in das Gehirn ist jedoch nicht nur eine Frage der Funktionalisierung von nanopartikulären Systemen mit spezifischen Peptidsequenzen. Vielmehr erlaubt ein Wissen über gewebespezifische Anforderungen der BHS die Entwicklung von maßgeschneiderten nanopartikulären Systemen. Liposomen stellen hierbei geeignete DDS für den Transport in das ZNS dar. Mittels der Ethanolinjektions-Methode wurden mehrere Liposomenformulierungen hergestellt, um die Auswirkung der Größe, Oberflächenladung, Pegylierungsdichte und die Verwendung von der mehrfach ungesättigten Fettsäure Docosahexaensäure (DHA) auf die zelluläre Bindung von Endothelzellen des Gehirns zu beurteilen.
Es ist erstaunlich, dass die analytischen Charakterisierungen dieser ausgeklügelten Formulierungen oft vernachlässigt werden. Obwohl der Formulierungsentwicklung von funktionalisierten Liposomen keine Grenzen gesetzt sind, fehlt es bei der analytischen Charakterisierung solcher DDS oft am Einsatz gängiger analytischer Techniken wie zum Beispiel der HPLC. Obwohl gerade die Herstellung von funktionalisierten Liposomen, aufgrund des mehrstufigen Herstellungsprozesses, die Quantifizierung von funktionalisierten Phospholipiden erfordert. Vor diesem Hintergrund wurde eine HPLC-Methode unter Verwendung der Lichtstreudetektion (ELSD, engl. Evaporative Light Scattering Detector) entwickelt, um alle Verbindungen einer PEG enthaltenden Liposomenformulierung zu bestimmen. Die entwickelte Methode wurde erfolgreich zur Quantifizierung von funktionalisierten Phospholipide während der Herstellung sowie zur Detektion von Abbauprodukten eingesetzt.
Die Funktionalisierung eines Liposoms erfordert hierbei die Verwendung von Phospholipiden, die reaktive Gruppen für die kovalente Bindung von Zielliganden wie etwa Viruspeptidsequenzen tragen. Die Reaktivität der funktionellen Gruppe ist deshalb eine Voraussetzung für die erfolgreiche Bindung des Zielliganden. Ein weiterer wichtiger Faktor ist, dass Funktionalisierungsstrategien von Liposomen oft mehrerer Vorbereitungsschritte bedürfen, welche eine Verzögerung der abschließenden Reaktion zur Folge hat. Dies ist insbesondere für funktionelle Gruppen kritisch, die einen Aktivitätsverlust erleiden. Ein Beispiel hierfür sind Maleinimide, welche aufgrund einer möglichen Hydrolyse bei höheren pH-Werten, während der Herstellung für einen Aktivitätsverlust anfällig sind. Durch die Verwendung eines indirekten Ellman-Assays wurden zwei gängige Vorbereitungsmethoden für funktionalisierte Liposomen, die Pre- und Post-Insertionsmethode, hinsichtlich ihrer Maleinimid-Stabilität untersucht.
Metadata last modified: 25 Nov 2020 21:04
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