Whole-cell biosensors are irreplaceable tool for studies of cellular mechanisms and behavior of the cell as a smallest living unit. Their development have progressed rapidly over past decades and nowadays we have powerful tools to study cell-based assays and to examine behavior of the cells exposed to different kinds of stimuli and challenges. Limited and selective permeability of the plasma ...
Zusammenfassung (Englisch)
Whole-cell biosensors are irreplaceable tool for studies of cellular mechanisms and behavior of the cell as a smallest living unit. Their development have progressed rapidly over past decades and nowadays we have powerful tools to study cell-based assays and to examine behavior of the cells exposed to different kinds of stimuli and challenges. Limited and selective permeability of the plasma membrane prevents the introduction of hydrophilic xenomolecules into the cytoplasm of mammalian cells. However, it is essential for many fields of cell biology, biomedicine or biotechnology to allow transport of such molecules (e.g. nucleic acids, antibodies, peptides or drugs) across the cell membrane. An ultimate goal of this thesis was to establish proof-of-principle assays for delivery of various bioactive molecules into adherent cells by in situ electroporation, and to monitor how these compounds influence cellular behavior, once they are internalized within the cell cytosol. Studies of in situ electroporation (ISE) were conducted using different types of mammalian cells (BAEC, CHO-K1/CHO-GFP, HaCaT, NRK and NIH-3T3) grown to confluence on small planar gold film electrodes. For every cell line individually, electric pulse parameters were optimized to achieve maximal loading efficiency, while keeping the invasiveness of the operation as low as possible. Impedance monitoring of in situ electroporation conducted with high time resolution showed biphasic changes of impedance signal after pulse application, indicating (i) fast recovery of the cell membrane integrity and (ii) relatively slow process of cell recovery after changes induced by membrane permeabilization. For the first time, release of intracellular material from the cells by ISE was studied using ECIS setup. Direct time-resolved imaging of NRK cells showed measurable efflux of fluorescence-labeled probes upon multiply applied electric pulses. In situ electroporation allowed transfer of second messenger (8-OH-)cAMP in the cell monolayers. Subsequent changes in impedance signal were in agreement with those observed after stimulation of the cells with membrane-permeable compounds CPT-cAMP and forskolin, as a consequence of triggering of the corresponding signaling cascades. Transport of nucleic acids into cytoplasm and nuclei of NRK and CHO-GFP cells was conducted in a highly-efficient manner. Besides fluorescent DNA aptamers, various types of siRNA molecules were successfully delivered into cells by in situ electroporation and their long-term sequence-specific silencing effect on cells was demonstrated and quantified by using microscopy and/ or impedance analysis. Transfection performance of ISE was compared with conventional and widespread delivery transfection method. In conclusion, this thesis demonstrated that in situ electroporation allows for highly efficient delivery of emerging types of molecules into monolayers of various types of cells.
Übersetzung der Zusammenfassung (Deutsch)
Zellbasierte Biosensoren sind ein unersetzbares Werkzeug um zelluläre Mechanismen und Funktionen der Zelle, als die kleinste lebende Einheit, zu erforschen. Zellbasierte Biosensoren haben sich in den letzten Jahrzehnten hin zu leistungsstarken Werkzeugen für Untersuchungen der zellulären Antwort auf verschiedene intra- und extrazelluläre Anregungen entwickelt. Dabei wird die Verfolgung von ...
Übersetzung der Zusammenfassung (Deutsch)
Zellbasierte Biosensoren sind ein unersetzbares Werkzeug um zelluläre Mechanismen und Funktionen der Zelle, als die kleinste lebende Einheit, zu erforschen. Zellbasierte Biosensoren haben sich in den letzten Jahrzehnten hin zu leistungsstarken Werkzeugen für Untersuchungen der zellulären Antwort auf verschiedene intra- und extrazelluläre Anregungen entwickelt. Dabei wird die Verfolgung von zellbasierten Assays ermöglicht. Die begrenzte und selektive Permeabilität von der Plasmamembran verhindert den Eintrag von den hydrophilen Molekülen in das Zytoplasma der Säugetierzellen. Für viele verschiedene Bereiche der Zellbiologie, Biomedizin, oder Biotechnologie ist es aber von großer Bedeutung, dass Moleküle wie z. B. Nukleinsäure, Antikörper, Peptide, oder Arzneimittel über die Zellmembran transportiert werden können. Ziel dieser Arbeit war es, die grundlegenden Assays für den Eintrag von bioaktiven Molekülen in adhärente Zellen mittels in situ Elektroporation zu etablieren. Dabei wurde verfolgt, wie Präsenz und Aktivität dieser Moleküle in dem Cytosol die Zellen beeinflusst. In situ Elektroporation (ISE) wurde an verschieden Zelllinien untersucht (BAEC, CHO-K1/CHO-GFP, HaCaT, NRK und NIH-3T3), welche auf kleinen planaren Goldfilmelektroden bis zur Konfluenz kultiviert wurden. Für jede Zelllinie wurden die Puls Parameter individuell für die Eintragsstudien optimiert, so dass die maximale Beladung mit möglichst wenig Invasivität erreicht wird. Impedanzmessungen mit hoher Zeitauflösung haben zweiphasige Signaländerungen nach dem elektrischen Puls gezeigt. Das bezeichnet (i) eine schnelle Erholung der Zellmembran und (ii) einen relativ langsamen Prozess der Zellerholung nach den Veränderungen, welche durch Zellmembranpermeabilisierung verursacht wird. Zum ersten Mal wurde die in situ Elektroporation in Kombination mit ECIS für die Freisetzung von dem intrazellulären Material aus den Zellen verwendet und untersucht. Direkte, zeitaufgelöste mikroskopische Bildgebung von NRK Zellen wurde verwendet, um das Ausströmen von Fluoreszenz-markierten Proben durch die sukzessive Zellmembranpermeabilisierung nachzuweisen. Außerdem ermöglicht in situ Elektroporation den Transfer von Second Messenger (8-OH-)cAMP in Zellmonoschichten. Die anschließenden Veränderungen des Impedanzsignals zeigten Übereinstimmung mit der Veränderung des Signals nach der Stimulation der Zellen in Gegenwart von membrangängigen cAMP-Stimulatoren CPT-cAMP und Forskolin. Der Transport von Nukleinsäuren in das Zytoplasma und den Nukleus der NRK und der CHO-GFP Zellen wurde erfolgreich als hoch effizient erwiesen. Neben den Fluoreszenz-markierten DNA Aptameren wurde der erfolgreiche Eintrag von den verschieden siRNA Typen durch in situ Elektroporation demonstriert. Dabei wurde ein langfristiger Sequenz-spezifischer Silencing Effekt von siRNA auf die Zellen mittels mikroskopischer Aufnahmen oder über Impedanzmessungen quantifiziert. Die Effizienz von der Transfektion der in situ Elektroporation wurde mit konventionellen chemischen Transfektionsreagenzien verglichen. Diese Arbeit hat demonstriert, dass die in situ Elektroporation einen hoch effizienten Eintrag von verschiedenen bioaktiven Molekülen in die Zellmonoschichten ermöglicht.
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