| License: Creative Commons Attribution No Derivatives 4.0 (1MB) |
- URN to cite this document:
- urn:nbn:de:bvb:355-epub-374044
- DOI to cite this document:
- 10.5283/epub.37404
| Item type: | Thesis of the University of Regensburg (PhD) |
|---|---|
| Date: | 21 June 2018 |
| Referee: | PD Dr. Frank Haubner |
| Date of exam: | 14 March 2018 |
| Institutions: | Medicine > Lehrstuhl für Hals-Nasen-Ohren-Heilkunde |
| Keywords: | platelet-rich plasma, PRP, Wundheilungsstörung, Strahlentherapie, HDMEC, hASC, Tube formation Assay |
| Dewey Decimal Classification: | 600 Technology > 610 Medical sciences Medicine |
| Status: | Published |
| Refereed: | Yes, this version has been refereed |
| Created at the University of Regensburg: | Yes |
| Item ID: | 37404 |
Abstract (German)
Die Grundlage der physiologischen Wundheilung bildet ein koordiniertes Ineinandergreifen fein aufeinander abgestimmter Mechanismen, in denen Wachstumsfaktoren eine relevante Rolle spielen. Die Anwendung ionisierender Strahlung, die bei Malignomen im Kopf-Hals-Bereich zum primären und adjuvanten Therapieregime zählt, gehört zu den Faktoren, die dieses sensible Gleichgewicht empfindlich stören. Als ...
Abstract (German)
Die Grundlage der physiologischen Wundheilung bildet ein koordiniertes Ineinandergreifen fein aufeinander abgestimmter Mechanismen, in denen Wachstumsfaktoren eine relevante Rolle spielen. Die Anwendung ionisierender Strahlung, die bei Malignomen im Kopf-Hals-Bereich zum primären und adjuvanten Therapieregime zählt, gehört zu den Faktoren, die dieses sensible Gleichgewicht empfindlich stören. Als Therapiemöglichkeit für strahleninduzierte Wundheilungsstörungen wird u.a. die exogene Stammzelltherapie untersucht. Desweiteren gilt plättchenreiches Plasma als potentes, autologes, pro-proliferatives Blutderivat. Dabei handelt es sich um ein autologes Blutplasma mit der 4-5-fachen Konzentration von Thrombozyten pro μl im Vergleich zu Vollblut. Die darin enthaltenen Wachstumsfaktoren könnten die lokale Verfügbarkeit von wundheilungsfördernden Mediatoren erhöhen und dadurch radiogenen Wundheilungsstörungen entgegenwirken. Um diese Hypothese auf zellulärer Ebene zu untersuchen, erarbeitete unsere Arbeitsgruppe zwei Modelle. Im ersten Modell wurden humane adipogene Stammzellen (hASC) und humane dermale mirkovaskuläre Endothelzellen (HDMEC) in Mono- und Ko-Kultur mit 2 Gray (Gy), 6 Gy oder 12 Gy bestrahlt oder blieben als Positivkontrolle unbestrahlt. Im Vergleich dazu wurde einem Teil der Zellkulturen 5% PRP oder 10% PRP zugesetzt. Gemessen wurden Veränderungen bezüglich der Zellzahlen und der Freisetzung von Wachstumsfaktoren (basic Fibroblast Growth Factor (bFGF), Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF), Platelet-derived Growth Factor (PDGF)), Zytokinen (Interleukin (IL)-6) und Adhäsionsmolekülen (soluble Intercellular Adhesion Molecule (sICAM) -1 und soluble Vascular Cellular Adhesion Molecule (sVCAM) -1), durch Applikation ansteigender Stahlendosen oder in Verbindung mit unterschiedlicher Konzentration des PRP. Die Konzentrationen der erwähnten Entzündungsmediatoren und Wachstumsfaktoren wurde in den Zellüberständen mittels ELISA bestimmt. Für das zweite Modell wurden pulmonale Fibroblasten mit HDMEC in einem Tube Formation Assay mit und ohne Zugabe von 5% PRP ko-kultiviert und zweimal mit jeweils 2 Gy bestrahlt und nach 7 Tagen der Effekt auf die Gefäßneubildung untersucht.
Als Ergebnis der Exposition mit ionisierender Strahlung, sank im ersten Modell die Zellzahl der HDMEC in Mono- und Ko-Kultur ab einer Strahlendosis von 6 Gy signifikant im Vergleich zur unbestrahlten Kontrolle ab. Bei hASC in Monokultur blieb
ein Strahleneffekt aus. Die Zugabe von 5% und 10% PRP zu hASC in Monokultur hingegen führte bei unbestrahlten und mit 2 Gy bestrahlten Kulturen zur Zellproliferation. Am deutlichsten konnte der pro-proliferative PRP-Effekt in der Ko-Kultur aus HDMEC und hASC gemessen werden. Hier zeigte sich eine signifikante Erhöhung der Zellzahl in unbestrahlten wie auch allen bestrahlten Ansätzen. In der unbestrahlten Kontrolle verdoppelte sich die Zellzahl der Ko-Kultur nach Zugabe des PRP nahezu, während nach Bestrahlung mit 6 Gy und 12 Gy eine Addition von 10% PRP die Zellzahl zurück bis auf das Ausgangsniveau der unbestrahlten Kontrolle brachte. Bezüglich der Proteinexpression zeigten HDMEC in Monokultur nach Bestrahlung zum Teil eine signifikante strahlendosisabhängige Steigerung der Konzentration von IL-6, PDGF, sICAM-1 und sVCAM-1. Die Zugabe von PRP verstärkte diesen Effekt bei der Expression von IL-6 und sICAM-1, während die Konzentration von PDGF durch Addition von PRP konzentrationsabhängig signifikant abfiel. In der Ko-Kultur konnte nach Bestrahlung eine dosisabhängige Steigerung der Konzentration von bFGF nachgewiesen werden. PRP steigerte diesen Effekt in der Ko-Kultur in bestrahlten Kulturen weiter, wohingegen es bei hASC und HDMEC in Monokultur die Freisetzung von bFGF inhibierte. Die Monokultur von hASC reagierte auf ionisierende Strahlung mit einer Reduktion von IL-6 sowie mit einer tendenziellen Steigerung der VEGF-Konzentration. PRP verstärkte die Proteinfreisetzung von VEGF in der hASC-Monokultur noch. Im zweiten Modell ergab die Auswertung der Tube Formation Assays mittels Mikroskop und Angioquant® Software anti-angiogene Effekte durch wiederholte Bestrahlung.
Bislang existieren wenige Therapien für radiogene Wundheilungsstörungen. Die daraus resultierende Morbidität stellt jedoch ein klinisch relevantes Problem dar. Die topische Anwendung von plättchenreichem Plasma greift durch die Erhöhung lokaler Wachstumsfaktoren, Adhäsionsmoleküle und Zytokine in die Proliferation und Proteinexpression der Schlüsselzellen der Wundheilung sowie in die Ausbildung neuer Gefäße ein. Insbesondere in Verbindung mit einer Ko-Kultur aus adipogenen Stammzellen und HDMEC können pro-proliferative Effekte des PRP nachgewiesen werden, die dem strahleninduzierten Zelluntergang effektiv entgegenwirken. Die Stimulation der Proteinexpression des Wachstumsfaktors bFGF durch PRP könnte hauptsächlich dazu beitragen. Mögliche negative Effekte des PRP, wie die Erhöhung von Adhäsionsmolekülen, könnten durch die gleichzeitige Präsenz von hASC abgeschwächt werden. Die Anwendung von PRP zusammen mit adipogenen Stammzellen könnte daher ein wirkungsvolles Instrument in der Therapie strahleninduzierter Wundheilungsstörungen darstellen.
Translation of the abstract (English)
Subtle mechanisms of growth factors play an important role in the cascade of physioligical wound healing. The use of radiation therapy, which is a major regime in the therapy of malign head and neck deseases can considerably destabilise this fine equilibrium of pocesses and cause wound healing disorders. Besides exogenic stem cell therapy platelet-rich plasma (PRP) is one of the suggested ...
Translation of the abstract (English)
Subtle mechanisms of growth factors play an important role in the cascade of physioligical wound healing. The use of radiation therapy, which is a major regime in the therapy of malign head and neck deseases can considerably destabilise this fine equilibrium of pocesses and cause wound healing disorders. Besides exogenic stem cell therapy platelet-rich plasma (PRP) is one of the suggested treatments in radiogenic wound healing complications due to its possible pro-proliferative and pro-angiogenic potential. PRP is a autologous concentration of human platelets in a small volume of human blood plasma which contains high levels of different growth factors. Local application of PRP could produce a healing enhancement in chronic radiogenic wounds or even work against them. To proof this hypothesis our team established two working models.
In the first working model human dermal microvascular endothelial cells (HDMEC) and human adipose derived stem cells (hASC) were cultured in a mono- and co-culture model and irradiated with dosis of 2 Gray (Gy), 6 Gy or 12 Gy or stayed non-irradiated as control. PRP in 5% and 10% were added to a part of the cell cultures. After 48 h alterations of cell counts and the level of growth factors such as basic fibroblast growth factor (bFGF), vascular endothelial growth factor (VEGF), platelet-derived growth factor (PDGF), cytokines like interleukine-6 (IL-6) and adhesion molecules like the soluble intercellular adhesion molecule (sICAM) and the soluble vascular cellular adhesion molecule (sVCAM) due to irradiation or addition of PRP were determined. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) was used.
In the second working model pulmonary fibroblasts and HDMEC were co-cultivated in a Tube Formation Assay and irradiated after 48 h and 72 h of cultivation to test the effect of radiation on vascularisation.
As a result of the first working model a significant decline of cell counts of HDMEC in mono- and co-culture after irradiation with 6 Gy were observed in comparison to the non-irradiated control. There was no radiation effect on hASC in monoculture. The addition of 5% and 10% PRP had pro-proliferative effects on non-irradiated hASC and hASC after 2 Gy in monoculture. The biggest pro-proliferative effect was determined in the co-culture of HDMEC and hASC. PRP caused a significant increase of cell counts in all cultures. Particulary the non-irradiated culture showed cell counts up to double. Addition of 10% PRP to co-cultures irradiated with dosis of 6 Gy and 12 Gy even restored the cell counts to levels of untreated, non-irradiated cultures. Concerning the expression of growth factors a dose-dependend significant increase of IL-6, PDGF, sICAM and sVCAM after irradiation was observed in the monoculture of HDMEC. PRP potentiated this effect regarding the expression of of IL-6 and sICAM whereas the levels of PDGF signifincantly declined depending on PRP concentration. Co-cultures of HDMEC and hASC showed a dose-dependend increase of bFGF expression. PRP even enhanced this effect in the co-cultures while showing inhibitory effects on the bFGF expression in HDMEC and hASC in monoculture. Expression of IL-6 decreased after irradiation of hASC in monoculture while the expression of VEGF showed the tendency to rise after irradiation and addition of PRP.
In the second working model the evaluation of the Tube Formation Assays via microscopy and the software Angioquant showed anti-angiogenic effects of repetitive irradiation.
There exist only few therapies for radiogenic wound healing disorders till now, although the resulting morbidity rate represents a relevant clinical problem. By increasing the local level of growth factors, adhesion molecules and cytokines, the topical use of PRP has an effect on the proliferation rate and expression of proteins of key cells of the cutaneous wound healing or the formation of new vessels. Especially in combination with a co-culture of hASC and HDMEC proliferative defects caused by external radiation can be restored. Probably by induction of bFGF. Possible negative effects of PRP coul be mitigated by the presents of hASC. Thus the combination of PRP and hASC could be effective in the therapy of radiogenic wound healing disorders.
Metadata last modified: 25 Nov 2020 19:41
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