| License: Creative Commons Attribution No Derivatives 4.0 (16MB) |
- URN to cite this document:
- urn:nbn:de:bvb:355-epub-379267
- DOI to cite this document:
- 10.5283/epub.37926
| Item type: | Thesis of the University of Regensburg (PhD) |
|---|---|
| Open Access Type: | Primary Publication |
| Date: | 31 October 2019 |
| Referee: | Prof. Dr. Dr. Hans Robert Kalbitzer |
| Date of exam: | 31 October 2018 |
| Institutions: | Biology, Preclinical Medicine > Institut für Biophysik und physikalische Biochemie Biology, Preclinical Medicine > Institut für Biophysik und physikalische Biochemie > Prof. Dr. Dr. Hans Robert Kalbitzer |
| Keywords: | Polycystin 2, ADPKD, mDia1 |
| Dewey Decimal Classification: | 500 Science > 500 Natural sciences & mathematics 500 Science > 570 Life sciences |
| Status: | Published |
| Refereed: | Yes, this version has been refereed |
| Created at the University of Regensburg: | Yes |
| Item ID: | 37926 |
Abstract (German)
Der nichtselektive Kationenkanal Polycystin-2 (PC2) ist das Genprodukt von PKD2, einem von zwei Genen, deren Mutation die Krankheit ADPKD, die am weitesten verbreitete monogenetische Erbkrankheit mit Todesfolge, bedingt. Der zytosolische C-Terminus von PC2 enthält zwei EF-Hand-Motive und vollzieht eine Konformationsänderung bei Kalziumbindung. Er interagiert außerdem mit einer Reihe von ...
Abstract (German)
Der nichtselektive Kationenkanal Polycystin-2 (PC2) ist das Genprodukt von PKD2, einem von zwei Genen, deren Mutation die Krankheit ADPKD, die am weitesten verbreitete monogenetische Erbkrankheit mit Todesfolge, bedingt. Der zytosolische C-Terminus von PC2 enthält zwei EF-Hand-Motive und vollzieht eine Konformationsänderung bei Kalziumbindung. Er interagiert außerdem mit einer Reihe von Proteinen, die an der Regulation der Kanalaktivität entscheidend beteiligt sind. Vieles deutet darauf hin, dass die verschiedenen Konformere des C-Terminus sowohl eine entscheidende Rolle bei der Kalziumbindung als auch der Interaktion von PC2 mit Zielproteinen spielen. Ziel dieser Arbeit war es, mit NMR-spektroskopischen Methoden verschiedene Konformere des C-Terminus von PC2 zu identifizieren und Einblick in ihre Funktion zu gewinnen.
Aufgenommene 1H-1H-TOCSY-, 1H-1H-NOESY- und 1D-1H-NOESY-Spektren zeigen zwei Zustände für PC2(680-796) in einem Verhältnis von ca. 60 (Zustand A) : 40 (Zustand B) an. Zustand B von PC2(680-796) weist mit einem KD-Wert im Bereich von 10 μM eine deutlich höhere Affinität für Kalziumionen auf als Zustand A, bei dem die Kalziumaffinität mit einem KD-Wert von ca. 137 μM um mindestens das zehnfache herabgesetzt ist. Es wurde außerdem ein dritter unbekannter kalziumabhängiger Prozess mit einem KD-Wert von ungefähr 612 μM identifiziert, der aber auch auf einen Ionenstärkeeffekt zurückzuführen sein könnte. Die durchgeführten Diffusionsmessungen zeigen für das Fragment PC2(680-796) mit 32048 ± 2527 g/mol eine scheinbare Molekülmasse etwas oberhalb eines Dimers an. Sehr wahrscheinlich stellt dieser Wert die Mischung eines Gleichgewichts von mono-, di- und tetrameren Zuständen von PC2(680-796) dar. Ein Strukturhomologieabgleich mit dem bekannten EF-Hand-Protein Calmodulin zeigte, dass die verwendeten Markersignale nicht in der potentiellen Interaktionsfläche eines PC2-Dimers liegen. Daher ist zu vermuten, dass das 60 : 40 Verhältnis kein Polymergleichgewicht widerspiegelt. Fragmente, denen der α-helikale Bereich vor der atypischen EF-Hand 1 fehlt, zeigten in früheren Studien bereits relativ geringe Kalziumaffinitäten. Das Fragment PC2(680-796) enthält eben diesen α-helikalen Bereich vor EF-Hand 1. Das lässt den Schluss zu, dass nur bei 40 % (Zustand B) von PC2(680-796) der α-helikale Bereich und damit wahrscheinlich EF-Hand 1 korrekt ausgebildet ist, was in hohen Affinitäten für Kalziumionen resultiert. Die korrekte Ausbildung dieses Bereichs kann von vielen Faktoren abhängen. Dies stellt auch einen möglichen Regulationsmechanismus im Hinblick auf die Kalziumaffinität des C-Terminus von PC2 dar.
Ein weiteres Ziel dieser Arbeit war es, mittels NMR-spektroskopischer Methoden die Interaktion des zytosolischen C-Terminus von PC2 mit dem Formin mDia1 zu untersuchen und die Binderegionen auf der 3D-Struktur zu definieren. Die Erkenntnisse aus den Interaktionsstudien sollten zu einem besseren Verständnis der Verbindungen von PC2 zum Aktinzytoskelett und der Steuerung der Kanalaktivität beitragen und dadurch auch einen möglichen Mechanismus der Zystenbildung aufzeigen. Für die Interaktionsstudien wurden die Fragmente PC2(680-796) und PC2(717-792) gewählt, von denen nur ersteres die α-helikalen Bereiche vor der atypischen EF-Hand 1 aufweist. Für PC2(680-796) wurde das bereits aus den Kalziumexperimenten bekannte ungefähre 60 (Zustand A) : 40 (Zustand B)-Verhältnis in den HSQC-Spektren bestätigt. Bei Zugabe von mDia1 zeigen Aminosäuren des Zustands B von PC2(680-796) die stärksten Änderungen. Es wurde ein mittlerer KD-Wert von 43 ± 20 μM für die Interaktion des Zustands B mit mDia1 errechnet. Zustand A besitzt eine deutlich schwächere Affinität für mDia1. Die Ergebnisse deuten auf keine Unterschiede bei den Interaktionsflächen für Zustand A bzw. B mit dem Formin mDia1 hin. Für PC2(717-792) wurde nur ein Zustand und eine schwache Affinität für mDia1 beobachtet. Auch dieses Fragment zeigt Interaktionsflächen im Bereich der EF-Hände und im Linker dazwischen. Falls, wie bereits vermutet, nur bei 40 % (Zustand B) von PC2(680-796) der α-helikale Bereich und damit wahrscheinlich EF-Hand 1 korrekt ausgebildet ist, wäre damit eine Bedingung für die mDia1-Interaktion identifiziert. Dass für Aminosäuren im α-helikalen Bereich starke Effekte vor allem der Zustände B beobachtet wurden, unterstützt diese These und deutet eventuell sogar auf eine direkte Beteiligung dieses Bereichs bei der Interaktion mit mDia1 hin.
Im weiteren Verlauf dieser Arbeit sollten die verschiedenen Konformere des zytosolischen C-Terminus von PC2 anhand des Fragments PC2(717-792) identifiziert werden. Proteine liegen normalerweise in konformationellen Gleichgewichten vor. Die Populationen verschiedener Konformere des Proteins im schnellen Austausch werden im thermischen Gleichgewicht von der Differenz der freien Enthalpien Δ????1????0 bestimmt. Durch die Anwendung von Hochdruck können Konformere, die unter Normaldruck nur schwach populiert sind, stabilisiert und sichtbar gemacht werden. Es wurden Spektren für PC2(717-792) bei Druckstufen von 1 MPa bis zu 250 MPa aufgenommen. Anhand der 1H- und 15N-chemischen Verschiebungsänderungen wurden Δ????0 und Δ????0, die freien Enthalpien bei Normaldruck bzw. die partiellen molaren Volumen bei Normaldruck, für die zwei Übergänge im 3-Zustandsmodell im schnellen Austausch errechnet. Es ergibt sich für den Übergang von Zustand 1 zu 2 ein Δ????120 von -3735 ± 42 J/mol und ein Δ????120 von -53 ± 18,28 ml/mol. Für den Übergang von Zustand 1 zu 3 ergibt sich ein Δ????130 von 9663 ± 25 J/mol und ein Δ????130 von -89,83 ± 0,56 ml/mol. Die freien Enthalpien Δ????0 bestimmen die Populationsverhältnisse der Zustände von PC2(717-792) und zeigen damit die relativen Konzentrationen der einzelnen Zustände des Proteins bei Normaldruck an. Aufgrund des Prinzips des kleinsten Zwangs verschiebt sich bei Druckanwendung die Population immer in Richtung des Zustands mit dem kleineren partiellen molaren Volumen. Unter Normaldruck zeigen die Diffusionsmessungen mit 16725 ± 998 g/mol die scheinbare Molekülmasse eines Dimers an, wie es bereits von dem Fragment PC2(680-796) unter diesen Bedingungen bekannt ist. Es ist sehr wahrscheinlich, dass sich hinter diesem Messwert eine Mischung aus Mono-, Di- und Tetrameren verbirgt. Im 3-Zustandsmodell von PC2(717-792) stellt bei Normaldruck Zustand 1 (20 %) wahrscheinlich das Tetramer, Zustand 2 (80 %) das Dimer und Zustand 3 (< 1%) das Monomer dar, wobei mit steigendem Druck der Tetrameranteil verschwindet und der Monomeranteil zunimmt. Die Kalziumfreisetzung scheint bei 160 MPa abgeschlossen zu sein. Die ermittelten Druckkoeffizienten B2* der kombinierten chemischen Verschiebungsänderungen zeigen starke konformationelle Effekte in den beiden C-terminalen Helices 3 und 4 (kanonische EF-Hand) an, während im Bereich der beiden N-terminalen Helices 1 und 2 (atypische EF-Hand) nur schwache Effekte beobachtet wurden. Dies spricht dafür, dass beim Fragment PC2(717-792), dem der α-helikale Bereich vor der atypischen EF-Hand 1 fehlt, nur die kanonische EF-Hand 2 Kalzium binden kann, da sonst durch die Kalziumfreisetzung Effekte bei EF-Hand 1 zu beobachten gewesen wären. Für verkürzte Fragmente ohne α-helikalen Bereich vor EF-Hand 1 wurden bereits verringerte Kalziumaffinitäten gezeigt. Es deutet somit vieles darauf hin, dass die korrekte Ausbildung der atypischen EF-Hand 1 für die Interaktion mit Kalziumionen und Proteinen wie dem Formin mDia1 essentiell ist. Bei der Ausbildung von EF-Hand 1 scheint der N-terminale α-helikale Bereich eine wichtige Rolle zu spielen.
Translation of the abstract (English)
Non-selective cation channel polycystin-2 (PC2) is the gene product of PKD2. PKD2 is one of two genes that cause - when mutated - ADPKD, the most prevailing hereditary disease leading to death. The cytosolic C-terminus of PC2 contains two EF-Hand motifs and undergoes conformational change at calcium binding. The C-terminus also interacts with a variety of proteins which are involved in regulation ...
Translation of the abstract (English)
Non-selective cation channel polycystin-2 (PC2) is the gene product of PKD2. PKD2 is one of two genes that cause - when mutated - ADPKD, the most prevailing hereditary disease leading to death. The cytosolic C-terminus of PC2 contains two EF-Hand motifs and undergoes conformational change at calcium binding. The C-terminus also interacts with a variety of proteins which are involved in regulation of the channel activity. There is evidence to suggest that the different conformers of the C-terminus play an important role in binding both calcium ions and target proteins. The purpose of this thesis was to identify different conformers of C-terminal PC2 with NMR-spectroscopy and to gain insight into their functions.
Recorded 1H-1H-TOCSY-, 1H-1H-NOESY- and 1D-1H-NOESY-spectra display two states for PC2(680-796) in a ratio of 60 (state A) : 40 (state B). State B shows an approximate KD = 10 μM and therefore much higher affinity for calcium ions compared to state A with an at least tenfold decreased affinity (KD = 137 μM). Another calcium-dependent process with an approximate KD = 612 μM was identified, which could be attributed to ionic strength effects. Diffusion measurements show apparent molecular masses of 32048 ± 2527 g/mol slightly above the value for a dimer of PC2(680-796). This value likely represents a mixture of mono-, di- and tetrameric states. Structural homology comparison with EF-hand protein calmodulin showed that the used marker signals do not lie in the potential interface of the PC2-Dimer. Therefore it has to be assumed that the 60 : 40 ratio does not represent the ratio of polymeric states. Fragments that are truncated and do not contain the α-helical region before the atypical EF-hand 1 displayed relatively low affinities for calcium in former studies. PC2(680-796) includes the α-helical region. This leads to the conclusion that only 40 % (state B) of PC2(680-796) form a correct α-helical region and EF-hand 1, which leads to high affinity for calcium ions. The correct formation of this region can depend on a lot of factors and could be a potential mechanism for regulation of calcium affinity.
Another purpose of this thesis was to identify the interactions of C-terminal PC2 with the formin mDia1 and to define the interacting residues. The insights gained should lead to a better understanding concerning the connections of PC2 to the actin cytoskeleton and regulation of channel activity. C-terminal PC2(680-796) and PC2(717-792) have been chosen for the interaction studies. Only PC2(680-796) contains the α-helical region before the atypical EF-hand 1. For PC2(680-796) the 60 (state A) : 40 (state B) ratio known from the calcium experiments was confirmed. When mDia1 was added to the sample, amino acids of state B displayed the major effects. An average KD = 43 ± 20 μM was calculated for the interaction of state B with mDia1. State A showed decreased affinity compared to state B. The results suggest no differences in interaction sites between state A and B. For PC2(717-792) only one state was detected that showed weak affinity for mDia1 and a KD of about 200 μM. This fragment also shows interaction sites in the region of the EF-hands and the linker. If, as concluded from the calcium experiments, only state B (40 %) forms a correct α-helical region and EF-hand 1, a requirement for the mDia1 interaction with C-terminal PC2 would be identified. Amino acids in the α-helical region show strong effects especially in their state B, therefore the α-helical region could be directly involved in interaction.
Another part of this thesis was to identify different conformers of the cytosolic C-terminus of PC2 using the fragment PC2(717-792). Proteins normally exist in conformational equilibria. The populations of different conformers under fast exchange conditions are determined by the differences in the Gibbs free energies Δ????1????0. Through application of high pressure conformers, which are almost not present under ambient pressure, can be stabilized. For PC2(717-792) spectra at pressures ranging from 1 MPa to 250 MPa have been recorded. The Gibbs free energy Δ????0 at ambient pressure and the partial molar volumes Δ????0 at ambient pressure have been calculated based on the chemical shift changes in a 3-state model. For transition from state 1 to 2 a Δ????120 = -3735 ± 42 J/mol and a Δ????120 = -53 ± 18,28 ml/mol was calculated. For transition from state 1 to 3 there is a Δ????130 = 9663 ± 25 J/mol and a Δ????130 = -89,83 ± 0,56 ml/mol. The Gibbs free energies Δ????0 determine the ratio of populations for PC2(717-792) and therefore show the relative concentrations of the states 1-3 at ambient pressure. Because of the Le Chatelier's principle the populations under pressure shift to the state with the lower partial molar volume. Under ambient pressure the diffusion measurements show the apparent molecular mass of a dimer (16725 ± 998 g/mol) as known for PC2(680-796) under these conditions. Probably, the value represents again a mixture of mono-, di-, and tetramers. In a 3-state model of PC2(717-792), state 1 (20 %) probably represents the tetramer, state 2 (80 %) the dimer and state 3 (< 1 %) the monomer. With pressure increasing the tetramer disappears and the monomer percentage rises. Calcium release seems to be completed at 160 MPa. The pressure coefficients B2* indicate strong conformational changes in the helices 3 and 4 (canonical EF-hand), whereas for helices 1 and 2 (atypical EF-hand) only weak effects have been detected. This leads to the conclusion that PC2(717-792) lacking the α-helical region before atypical EF-hand 1 can bind calcium only in the canonical EF-hand 2. Otherwise effects resulting from the calcium release would have been measured. Truncated fragments lacking the α-helical region of C-terminal PC2 displayed reduced affinity for calcium in former studies. The results in this thesis suggest that correct formation of EF-hand 1 of C-terminal PC2 is essential for the interaction with calcium ions and other proteins like the formin mDia1. The α-helical region may be crucial to the formation of EF-hand 1.
Metadata last modified: 25 Nov 2020 15:43
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