| License: Creative Commons Attribution 4.0 PDF - Submitted Version Dissertation (5MB) |
- URN to cite this document:
- urn:nbn:de:bvb:355-epub-384243
- DOI to cite this document:
- 10.5283/epub.38424
| Item type: | Thesis of the University of Regensburg (PhD) |
|---|---|
| Open Access Type: | Primary Publication |
| Date: | 29 January 2020 |
| Referee: | Prof. Dr. Achim Göpferich |
| Date of exam: | 1 February 2019 |
| Institutions: | Chemistry and Pharmacy > Institute of Pharmacy > Pharmaceutical Technology (Prof. Göpferich) |
| Keywords: | neurokinin-1 receptor; substance P; antagonist; multivalency; neurogenic inflammation; PEGylated antagonists; binding studies; avidity; affinity |
| Dewey Decimal Classification: | 600 Technology > 615 Pharmacy |
| Status: | Published |
| Refereed: | Yes, this version has been refereed |
| Created at the University of Regensburg: | Yes |
| Item ID: | 38424 |
Abstract (English)
The goal of this thesis was to investigate the neurokinin-1 receptor (NK1R) as a potential target site for multivalent receptor blockade. Since the NK1R is peripherally expressed on various cell types of the human body and its expression increases when an immune response occurs, this receptor seems to offer great potential for selective and specific antagonistic surface receptor targeting with a ...
Abstract (English)
The goal of this thesis was to investigate the neurokinin-1 receptor (NK1R) as a potential target site for multivalent receptor blockade. Since the NK1R is peripherally expressed on various cell types of the human body and its expression increases when an immune response occurs, this receptor seems to offer great potential for selective and specific antagonistic surface receptor targeting with a minimizing effect of inflammation and pain.
In the experiments described in Chapter 3, it was found that the inflammatory factor IL-1β has a direct influence on NK1R expression levels in human U87 MG glioblastoma and MDA-MB-231 breast cancer cell lines and primary bovine chondrocytes in 2D cell culture. In addition, it could be demonstrated in 2D cell cultures that IL-1β and substance P together contribute to the regulation of the chondrocytes´ surrounding extracellular matrix (ECM) behavior by the selective regulation of matrix-metalloproteinases´ (MMPs) gene expression. In this context, it could be shown that MMP-13 in particular is regulated in a time and concentration-dependent manner by substance P and can be antagonized by the specific NK1R antagonist spantide I, which allows to assume that this intracellular signaling pathway is triggered via NK1Rs. This aspect is intriguing since the literature also mentions that MMP-13 has an impact on the progression of arthritis.
In Chapter 4, fluorescent PEGylated quantum dots (QDs) were used for ligand coupling to the surface of nanoparticles and to study their interactions with NK1R positive cells. The introduction of thiol groups into cysteine-free peptide ligands is a common strategy for coupling well water-soluble ligands to maleimide functionalized nanoparticles such as QDs. In nanoparticle uptake experiments with receptor positive CHO-NK1R cells, a high unspecific nanoparticle binding for amino-PEG modified QDs was examined. However, in FACS displacement experiments with high concentrations of free competing antagonists it was shown that nanoparticle binding was inhibited. This indicated receptor mediated nanoparticle binding.
Besides PEGylated QDs, branched 8-arm PEGs were used in Chapter 5 for multivalent cell interaction studies. In contrast to QDs, PEGs are classified as nontoxic biomaterials; additionally, they do not interfere with luminescence-based calcium assays. It was shown that there is a gain in affinity for 8armPEG-20k-spantide I due to multivalent receptor binding.
In Chapter 6, a small molecular weight antagonist, aprepitant, was modified to make it amenable for further PEG coupling, either to branched PEGs or PEG-coated nanoparticles. It could be shown that chemical modification of the triazole group of aprepitant is possible by using a strong deprotonation reagent and a tert-Butyl-(3-bromopropyl)carbamate as an alkyl linker with Bocprotected amine functionality.
Another new strategy for site-specific multivalent nanoparticle targeting is presented in the final chapter, Chapter 7. This strategy is based on an enzyme driven activation mechanism of ligands which are immobilized on the surface of nanoparticles. For these studies, the ACE driven angiotensin I to angiotensin II conversion was used and the successful conversion was checked by AT1 receptor binding studies. The results of these experiments have shown that enzymatically processed angiotensin I coated nanoparticles are able to selectively bind to AT1R positive mesangial cells.
Translation of the abstract (German)
Im Rahmen dieser Arbeit wurde der Neurokinin-1 Rezeptor (NK1R) als potentielles Target zur multivalenten Rezeptorblockade untersucht. Da der NK1R von verschiedenen Zelltypen des menschlichen Körpers exprimiert wird und seine Expression im Zuge einer Immunantwort zunimmt, scheint dieser Rezeptor vielversprechend für seine selektive und spezifische Antagonisierung zur Eindämmung von Entzündungen ...
Translation of the abstract (German)
Im Rahmen dieser Arbeit wurde der Neurokinin-1 Rezeptor (NK1R) als potentielles Target zur multivalenten Rezeptorblockade untersucht. Da der NK1R von verschiedenen Zelltypen des menschlichen Körpers exprimiert wird und seine Expression im Zuge einer Immunantwort zunimmt, scheint dieser Rezeptor vielversprechend für seine selektive und spezifische Antagonisierung zur Eindämmung von Entzündungen und Schmerzreaktionen zu sein.
Die Experimente in Kapitel 3 zeigen, dass der inflammatorische Faktor IL-1β einen direkten Einfluss auf die NK1R Expression in menschlicher U87 MG Glioblastomzellen und MDA-MB-231 Brustkrebszellen, sowie primäre bovine Chondrozyten in 2D Zellkultur hat. Es konnte zudem gezeigt werden, dass IL-1β und Substanz P gemeinsam durch die selektive Regulation der genetischen Expression von Matrixmetalloproteinasen (MMPs) zur Regulation der extrazellulären Matrix (ECM), welche die Zellen umgibt beitragen. Insbesondere MMP-13 wird zeit- und konzentrationsabhängig durch Substanz P reguliert und kann durch den spezifischen NK1R Antagonist Spantide I inhibiert werden. Dieser Aspekt ist interessant, denn in der Fachliteratur wird ebenfalls diskutiert, dass MMP-13 am Voranschreiten von Arthritis beteiligt ist.
In Kapitel 4, wurden PEGylierte Quantenpunkete (QDs) zur Ligandkopplung auf der Oberfläche von Nanopartikeln verwendet um deren Interaktion mit NK1R positiven Zellen zu untersuchen. Die Einführung von Thiolgruppen in Cystein-freie Peptidliganden ist eine gängige Strategie zur Kopplung gut wasserlöslicher Liganden an Maleimid-funktionalisierte Nanopartikel, wie QDs. In Experimenten, die sich mit der zellulären Aufnahme von Nanopartikeln in Rezeptor positive CHO-NK1R Zellen beschäftigen, konnte eine starke unspezifische Nanopartikelbindung von Amino-PEG modifizierten QDs beobachtet werden. Im Rahmen von FACS basierten kompetetiven Verdrängungsversuchen konnte jedoch gezeigt werden, dass die Nanopartikelbindung durch die Zugabe eines freien Antagonisten inhibiert wird, was eine Rezeptor abhängige Nanopartikelbindung beweist.
Neben PEGylierten QDs wurden verzweigten 8-arm PEGs in Kapitel 5 für multivalente Zellinteraktionsstudien verwendet. Im Gegensatz zu QDs, werden PEGs als nicht-toxische Biomaterialien klassifiziert. Zudem interagieren sie nicht mit Lumineszenz-basierten Calciumassays. Es konnte gezeigt werden, dass das 8armPEG-20k-Spantide I einen Anstieg in seiner Affinität aufgrund einer multivalenten Rezeptorbindung erfährt.
In Kapitel 6 wurde ein niedermolekularer Antagonist namens Aprepitant modifiziert um ihn für eine weitere PEG-Kopplung, entweder an verzweigtes PEG oder PEG-beschichtete Nanopartikel zugänglich zu machen. Es konnte gezeigt werden, dass die chemische Modifikation der Triazolgruppe von Aprepitant unter dem Einsatz eines starken Deprotonierungsreagenz und eines Tert-Butyl-(3-bromopropyl)carbamats als ein Alkyllinker mit einer Boc-geschützten Aminfunktionalität möglich ist.
Im letzten Kapitel, Kapitel 7 wird eine weitere neue Strategie für spezifisches multivalentes Nanopartikel-Targeting vorgestellt. Diese Strategie basiert auf einem Enzym-getriebenen Aktivierungsmechanismus von auf der Oberfläche von Nanopartikeln immobilisierten Liganden. Für diese Studien wurde die ACE getriebene Konversion von Angiotensin I zu Angiotensin II verwendet und die erfolgreiche Konversion durch AT1-Rezeptorbindungsstudien überprüft. Die Ergebnisse dieser Experimente haben gezeigt, dass enzymatisch prozessierte Angiotensin I-beschichtete Nanopartikel in der Lage sind selektiv an AT1R positive Mesangialzellen zu binden.
Metadata last modified: 25 Nov 2020 18:29
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