| Lizenz: Creative Commons Namensnennung 4.0 International PDF - Angenommene Version Chromatin alterations during transformation of B cells by a constitutively active mutant of STAT5 (12MB) |
- URN zum Zitieren dieses Dokuments:
- urn:nbn:de:bvb:355-epub-384326
- DOI zum Zitieren dieses Dokuments:
- 10.5283/epub.38432
| Dokumentenart: | Hochschulschrift der Universität Regensburg (Dissertation) |
|---|---|
| Open Access Art: | Primärpublikation |
| Datum: | 15 März 2019 |
| Begutachter (Erstgutachter): | PD Dr. Anne Rascle |
| Tag der Prüfung: | 7 März 2019 |
| Institutionen: | Medizin > Lehrstuhl für Immunologie |
| Stichwörter / Keywords: | STAT5 Chromatin Histone Nucleosome Cancer Oncogenesis Cis Spi2.1 c-Myc Pim-1 |
| Dewey-Dezimal-Klassifikation: | 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 500 Naturwissenschaften 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 570 Biowissenschaften, Biologie 600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften > 610 Medizin |
| Status: | Veröffentlicht |
| Begutachtet: | Ja, diese Version wurde begutachtet |
| An der Universität Regensburg entstanden: | Ja |
| Dokumenten-ID: | 38432 |
Zusammenfassung (Englisch)
The transcription factor signal transducer and activator of transcription 5 (STAT5) is activated conditionally and transiently by external stimuli. Thereupon, STAT5 modulates the transcription of its target genes, promoting cell survival and growth. Constitutive STAT5 activity has been shown to be oncogenic in hematopoietic cells. This correlates with the acquisition of cancer hallmarks, such as ...
Zusammenfassung (Englisch)
The transcription factor signal transducer and activator of transcription 5 (STAT5) is activated conditionally and transiently by external stimuli. Thereupon, STAT5 modulates the transcription of its target genes, promoting cell survival and growth. Constitutive STAT5 activity has been shown to be oncogenic in hematopoietic cells. This correlates with the acquisition of cancer hallmarks, such as ‘cytokine-independent survival’, ‘uncontrolled growth’ and ‘genomic instability’. Chromatin dynamics is of pivotal importance for the regulation of transcriptional activity and DNA damage repair. Accordingly, cancer hallmarks are not only effected by oncogenic ‘driver’ alterations at the DNA level, but also at the chromatin level. Sustained DNA binding of constitutively active STAT5 might have distinct effects on chromatin, which might lead to ‘driver’ chromatin alterations and underlie its oncogenicity.
The main goal of the present study was to identify ‘driver’ chromatin alterations and other ‘driver’ events during the oncogenesis process induced by constitutively active STAT5. The constitutively active STAT5 mutant STAT5A-1*6 was previously shown to induce oncogenesis in the IL-3-dependent pro-B cell line Ba/F3 by enabling cytokine-independent survival and growth. Specific aims of this study were to characterize the effects of STAT5A-1*6 expression on (i) cell survival and growth, (ii) expression of selected STAT5 target genes and (iii) chromatin rearrangements.
To monitor the oncogenesis process, a stable Ba/F3 cell line – inducibly expressing STAT5A-1*6 upon doxycycline administration (Tet-on expression system) – was generated and validated. Short- and long-term STAT5A-1*6 induction experiments were conducted and STAT5A-1*6 protein levels and activation (Western blot), and cell phenotype in terms of survival, growth and genome stability (cell counting, flow cytometric analysis of cellular DNA content/cell cycle states) were analyzed. Expression of STAT5 target genes including Cis, Osm, Spi2.1, c-Myc, Pim-1, Id-1 and TNFRSF13b was investigated in parallel using RT-qPCR. As expected, STAT5A-1*6 expression enabled cytokine-independent survival and growth of Ba/F3 cells. Cell viability and proliferation rates increased gradually during the initial phase of induction. Interestingly, after 4–5 weeks of induction cell survival and growth no longer depended on STAT5A-1*6 expression. In addition, in one out of four experiments, STAT5A-1*6-expressing cells accumulated chromosomal aberrations. The correlation patterns of STAT5A-1*6 and STAT5 target gene expression suggested dose-dependent STAT5A-1*6-mediated transcriptional activation of STAT5 target genes, at least within the first few weeks of induction. Later on however, sustained expression of the STAT5 target genes c-Myc and Pim-1 became independent of STAT5A-1*6. Altogether, these observations suggest the acquisition of the ‘cytokine-independent survival’, ‘uncontrolled growth’ and ‘genomic instability’ cancer hallmarks, possibly due to continually
accumulating ‘driver’ alterations upon sustained expression of STAT5A-1*6.
Interestingly, using chromatin immunoprecipitation STAT5 DNA binding to Cis, Osm, Spi2.1, Id-1 and TNFRSF13b was correlated with a strong decrease in histone H3 occupancy, likely reflecting a loss in nucleosomes. This histone H3 loss was particularly prominent at the STAT5 binding sites, regardless of (i) their location within the gene locus, of (ii) transcriptional activation and of (iii) cytokine supplementation. In addition, sustained STAT5A-1*6 DNA binding patterns were associated with broadened histone H3 loss in regions distant from STAT5 binding sites. Taken together, these data strongly suggest that DNA binding of STAT5 causes a local nucleosome loss, and possibly a global nucleosome loss along its target genes. Accordingly, I propose a general STAT5-mediated chromatin decondensation mechanism leading to a nucleosome loss around STAT5 binding sites, at a step preceding transcriptional activation. The broadened STAT5A-1*6-associated histone H3 loss patterns also raise the possibility of distinct STAT5A-1*6-mediated ‘driver’ chromatin alterations, which might misregulate chromatin dynamics and, in turn, promote the acquisition of ‘driver’ DNA alterations (i.e. the ‘genomic instability’ cancer hallmark). Together, these DNA and chromatin alteration events might underlie the oncogenicity of constitutively active STAT5. Further characterization of these events might contribute to a better understanding of the mechanism of STAT5-mediated oncogenesis and possibly to the identification of novel molecular targets for the development of drugs against STAT5-associated cancers.
Übersetzung der Zusammenfassung (Deutsch)
Der Transkriptionsfaktor signal transducer and activator of transcription 5 (STAT5) wird von externen Stimuli zeitlich begrenzt aktiviert. Daraufhin moduliert STAT5 die Transkription seiner Zielgene und vermittelt so eine Zellüberlebens- und Zellwachstumsantwort. Konstitutive STAT5-Aktivität ist onkogen und an der Leukämie- und Lymphomentstehung aus blutbildenden Zellen beteiligt. Diese ...
Übersetzung der Zusammenfassung (Deutsch)
Der Transkriptionsfaktor signal transducer and activator of transcription 5 (STAT5) wird von externen Stimuli zeitlich begrenzt aktiviert. Daraufhin moduliert STAT5 die Transkription seiner Zielgene und vermittelt so eine Zellüberlebens- und Zellwachstumsantwort. Konstitutive STAT5-Aktivität ist onkogen und an der Leukämie- und Lymphomentstehung aus blutbildenden Zellen beteiligt. Diese erwerben dabei Krebsmerkmale wie ‘zytokin-unabhängiges Überleben’, ‘unkontrolliertes Wachstum’ und ‘Genominstabilität’. Die Chromatindynamik ist von zentraler Wichtigkeit für die Regulierung der Transkriptionsaktivität und die Reparatur von DNA-Schäden. Dementsprechend verursachen nicht nur krebsbedingende sogenannte ‘Treiber’-Veränderungen auf DNA-Ebene Krebsmerkmale, sondern auch solche auf Chromatin- Ebene. Daher könnte die dauerhafte DNA-Bindungsaktivität von konstitutiv aktivem STAT5 spezifische Effekte auf das Chromatin haben, die zu ‘Treiber’-Chromatinveränderungen führen und so dessen Onkogenität zugrunde liegen.
Das Hauptziel der vorliegenden Arbeit war die Identifizierung von ‘Treiber’-Chromatinveränderungen und anderer ‘Treiber’-Ereignisse während der von konstitutiv aktivem STAT5 induzierten Onkogenese. Es wurde bereits gezeigt, dass die konstitutiv aktive STAT5-Mutante STAT5A-1*6 in der IL-3-abhängigen pro-B-Zelllinie Ba/F3 Onkogenese induziert, indem sie den Zellen zytokin-unabhängiges Überleben und Wachstum ermöglicht. Die vorliegende Arbeit sollte daher im Einzelnen die Effekte der STAT5A-1*6-Expression auf (i) das Zellüberleben und -wachstum, (ii) die Expression ausgewählter STAT5-Zielgene und (iii) Chromatinumstrukturierungen charakterisieren.
Um die Onkogenese im Zeitverlauf zu beobachten, wurde eine stabile Ba/F3-Zelllinie entwickelt und validiert, die über Doxycyclin-Gabe induzierbar STAT5A-1*6 exprimiert (Tet-on-Expressionssystem). Nach Induktion der STAT5A-1*6-Expression wurden in Zeitkursexperimenten STAT5A-1*6-Proteinlevel und -Aktivierung (Western blot) sowie der Überlebens- und Wachstumsphänotyp und die Genomstabilität (Zellzählung, durchflusszytometrische Bestimmung des Zell-DNA-Gehalts und der Zellzyklusphase) und die Gesamt-DNA-Menge (Zellzyklusanalyse) analysiert. Zusätzlich wurde mittels RT-qPCR die Expression von STAT5-Zielgenen, u.a. Cis, Osm, Spi2.1, c-Myc, Pim-1, Id-1 und TNFRSF13b, untersucht. Wie erwartet ermöglichte die STAT5A-1*6-Expression Ba/F3-Zellen zytokin-unabhängiges Überleben und Wachstum. Zu Beginn der Zeitkursexperimente nahmen Zellviabiliäts- und Zellproliferationsraten fortlaufend zu. Interessanterweise hingen aber Zellüberleben und -wachstum nach 4–5 Wochen nicht mehr von der STAT5A-1*6-Expression ab. Zudem akkumulierten die Zellen in einem von vier Experimenten Chromosomenaberrationen. Die Expressionsstärke von STAT5A-1*6 korrelierte darüber hinaus mit der von STAT5-Zielgenen – zumindest in den ersten Wochen. Das wies auf eine dosis-abhängige Transkriptionsaktivierung der STAT5-Zielgene durch STAT5A-1*6 hin. Die STAT5-Zielgene c-Myc und Pim-1 wurden hingegen zu späteren Zeitpunkten zunehmend STAT5A-1*6-unabhängig exprimiert. Zusammengenommen legen diese Beobachtungen den Erwerb der Krebsmerkmale ‘zytokin-unabhängiges Überleben’, ‘unkontrolliertes Wachstum’ und ‘Genominstabilität’ nahe – womöglich aufgrund stetig akkumulierender ‘Treiber’-Veränderungen bei langanhaltender STAT5A-1*6-Expression.
Chromatin-Immunpräzipitationsexperimente zeigten, dass die STAT5-DNA-Bindung an den Cis, Osm, Spi2.1, Id-1 und TNFRSF13b-Loci mit einer starken Abnahme im Histon-H3-Gehalt korrelierte. Dies spiegelt wahrscheinlich einen Nukleosomenverlust wider. Besonders ausgeprägt war der Histon-H3-Verlust an STAT5-Bindestellen, ungeachtet (i) deren Lage innerhalb des Genlokus, (ii) von Transkriptionsaktivierung und (iii) von Zytokin-Gabe. Zudem korrelierte die anhaltende STAT5A-1*6-DNA-Bindung mit einer Ausdehnung des Histon-H3-Verlusts. Diese Daten lassen den Schluss zu, dass die Bindung von STAT5 an DNA einen Nukelosomenverlust an dessen Bindestelle und möglicherweise auch überall entlang seiner Zielgene verursacht. Daraus könnte sich ein allgemeiner STAT5-vermittelter Chromatindekondensierungs-Mechanismus ableiten, bei dem es zu Nukleosomenverlust in der Umgebung von STAT5-Bindestellen kommt (an einem Schritt vor STAT5-vermittelter Transkriptionsaktivierung). Aus den Ausdehnungsmustern des STAT5A-1*6-assoziierten Histon-H3-Verlusts lässt sich schlussfolgern, dass STAT5A-1*6 spezifische ‘Treiber’-Chromatinveränderungen verursachen könnte. Diese könnten die Chromatindynamik beeinflussen und so wiederum den Erwerb von ‘Treiber’-DNA-Veränderungen (d.h. des Krebsmerkmals ‘Genominstabilität’) begünstigen. Gemeinsam könnten solche DNA- und Chromatinveränderungsereignisse der Onkogenität von konstitutiv aktivem STAT5 zugrunde liegen. Die weitere Charakterisierung dieser Ereignisse könnte dazu beitragen, den Mechanismus hinter STAT5-vermittelter Onkogenese besser zu verstehen. Das könnte neue molekulare Ansatzpunkte für die Entwicklung von Medikamenten gegen STAT5- assoziierte Krebsformen eröffnen.
Metadaten zuletzt geändert: 25 Nov 2020 18:29
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