| License: Publishing license for publications excluding print on demand (27MB) |
- URN to cite this document:
- urn:nbn:de:bvb:355-epub-406296
- DOI to cite this document:
- 10.5283/epub.40629
| Item type: | Thesis of the University of Regensburg (PhD) |
|---|---|
| Open Access Type: | Primary Publication |
| Date: | 5 August 2019 |
| Referee: | Prof. Dr. Reinhard Sterner |
| Date of exam: | 24 July 2019 |
| Institutions: | Biology, Preclinical Medicine > Institut für Biophysik und physikalische Biochemie > Prof. Dr. Reinhard Sterner |
| Keywords: | Gene Therapy; Gene Delivery; Targeting; Antibody; TriFab; Plasmid DNA; Chromatin; CRISPR/Cas9; Hapten; Diphtheria Toxin; |
| Dewey Decimal Classification: | 500 Science > 500 Natural sciences & mathematics 500 Science > 570 Life sciences |
| Status: | Published |
| Refereed: | Yes, this version has been refereed |
| Created at the University of Regensburg: | Partially |
| Item ID: | 40629 |
Abstract (English)
The focus of this PhD thesis is the development of a novel strategy for specific and efficient delivery of gene expression systems for targeted genome editing. To mediate efficient transgene expression only inside the nuclei of the cells of interest, an optimization of every step along the gene delivery route as outlined in the following is absolutely mandatory: 1. Specific delivery to the ...
Abstract (English)
The focus of this PhD thesis is the development of a novel strategy for specific and efficient delivery of gene expression systems for targeted genome editing. To mediate efficient transgene expression only inside the nuclei of the cells of interest, an optimization of every step along the gene delivery route as outlined in the following is absolutely mandatory:
1. Specific delivery to the target cells
2. Efficient translocation to the nucleus
3. Expression and functionality of the gene product
To structure this comprehensive research project, the thesis is divided into three individually addressed
work packages according to the delivery route but in a strategic reasonable order. First of all, the functionality of the gene expression system must be quantifiable in a robust and simple manner to enable optimization of the preceding steps. For the delivery of reporter genes various robust methods for quantification exist like GFP expression and its evaluation via flow cytometry for example. However, the final goal of this thesis is the delivery of targeted genome editing systems like CRISPR/Cas9. Quantification of gene editing is often combined with time consuming assays or is based on low overall numbers. To address this bottleneck, an assay for robust quantification of a huge number of individual genome editing events has been developed. This assay exploits cell survival and subsequent colony formation due to gain of toxin resistance for the quantification of transgene integration and homozygous gene inactivation. For transgene integration, puromycin-Nacetyltransferase gene is the transgene of choice, as integration events can be quantified by cell survival and colony formation after puromycin selection. Homozygous gene inactivation is quantified by targeting of genes essential for diphthamide synthesis, followed by diphtheria toxin selection and quantification of toxin resistant survivor cell colonies. Highlight of this assay is the determination of the absolute editing frequencies mediated by CRISPR/Cas9 and the demonstration that CRISPR/Cas9 editing efficiencies are comparable to the efficiencies of zinc finger nucleases. On the basis of the determined frequencies it is reasoned that site specific integration events with an absolute ratio of 0.12% are too infrequent for therapeutic application. Homozygous knock out with 6% frequency on the other hand might be considered for therapy if not every cell needs to be addressed and is therefore selected in this thesis for further development of a targeted gene delivery system. All in all, this assay provides the basis for the evaluation of the developed gene delivery system. Specific transgene expression exclusively in the tissue or cells of interest presupposes membrane binding and internalization predominantly at the target cells, the focus of the second work package. Such discrimination between target and non-target cells can be realized by antibodies or antibody derivatives. For flexible coupling of payloads like nucleic acids with ability for intracellular release, bispecific hapten binding antibody formats are used. These antibody derivatives comprise specificity against the cell surface antigen and a second specificity against a hapten like biotin or digoxigenin. Haptenylation of DNA or DNA binding entities generates a flexible platform with ability to compare various antibody formats or payloads. The design, production, purification and characterization are the fundamental steps for the development of every antibody or antibody derivative and are described with the novel hapten binding TriFab format. Furthermore, the broad applicability of the hapten system is demonstrated by targeted delivery of various payloads like small molecules, nucleic acids or proteins by the TriFab in comparison to the bivalent and bispecific antibody format. The characteristics of the different antibody formats and the rationale of particular engineering aspects are discussed. After demonstration that the hapten system is suitable for intracellular delivery of various compounds, compatibility of this system for gene delivery is investigated. To facilitate nuclear delivery of plasmid DNA, this large double stranded circular nucleic acid is organized into plasmid chromatin via histone assembly by salt gradient dialysis. The properties favored for efficient and functional translocation of plasmid DNA into the nucleus like improved nuclease resistance and charge reduction are demonstrated after generation of high quality chromatin. The connection between chromatin and hapten binding antibody derivatives was realized by a DNA binding peptide (CPXM2 peptide) derived from human carboxypeptidase-like protein X2 (CPXM2 protein). Comparison of TriFab and bivalent bispecific antibodies in combination with the haptenylated DNA binding peptide outlined that the latter format has greater affinity to DNA most likely due to bivalent peptide / DNA interaction and is therefore chosen for further characterization and development. It could be demonstrated that this antibody-peptide complex is able to target plasmid DNA and plasmid chromatin with similar efficiency and high specificity to the target cells. The impact of histone mediated DNA condensation was pointed out by comparison of reporter gene expression. Plasmid DNA targeting did not result in a significant number of transgene expressing cells, whereas targeted plasmid chromatin generated high portions of reporter gene expressing cells. Finally, the initially developed assay is used to evaluate the compatibility of plasmid chromatin targeting with CRISPR/Cas9 genome editing systems. The significant number of cell clones with homozygous target gene knock out proves the applicability of this system for efficient delivery of targeted genome editing. Moreover, the high specificity of the delivery system to the target cells might open up a novel strategy for systemic application of a genome editing system for gene therapy. In conclusion, this thesis describes the development of a novel system for specific and efficient gene delivery with components exclusively of human or mammalian origin.
Translation of the abstract (German)
Die vorliegende Doktorarbeit befasst sich mit der Entwicklung eines Systems für die gezielte Verabreichung von Transgenen zur spezifischen, therapeutischen Genom-Editierung. Damit ein Gentherapeutikum systemisch optimal wirksam ist, müssen drei Schritte gezielt adressiert werden: 1. Spezifische Aufnahme des Transgens allein durch die Zielzelle 2. Effiziente Translokation des Transgens in den ...
Translation of the abstract (German)
Die vorliegende Doktorarbeit befasst sich mit der Entwicklung eines Systems für die gezielte Verabreichung von Transgenen zur spezifischen, therapeutischen Genom-Editierung. Damit ein Gentherapeutikum systemisch optimal wirksam ist, müssen drei Schritte gezielt adressiert werden:
1. Spezifische Aufnahme des Transgens allein durch die Zielzelle
2. Effiziente Translokation des Transgens in den Nukleus
3. Expression und Funktionalität des therapeutischen Genprodukts
Auf diese Weise wurde auch das Forschungsprojekt strukturiert, wodurch drei Arbeitspakete entstanden, die nacheinander adressiert werden konnten. Die Reihenfolge der Bearbeitung wurde strategisch so gelegt, dass zunächst die Funktionalität des Genprodukts quantitativ bestimmt werden konnte, um anschließend die ersten beiden Schritte validieren zu können. Diese Quantifizierung ist im Falle von Reportergenen relativ einfach, da viele verschiedene und robuste Methoden etabliert sind. Ein Beispiel ist die Expression des GFP Reportergens und die schnelle und präzise Quantifizierung der GFP exprimierenden Zellen mittels Durchflusszytometrie. In dieser Arbeit soll final jedoch ein System zur Genom-Editierung wie beispielsweise das CRISPR/Cas9 System verwendet werden. Für die Quantifzierung von Genom-Editierung sind einfache und robuste Methoden bislang jedoch kaum vorhanden. Vielmehr sind die quantitativen Auswertungen der verschiedenen Editierungsereignisse meist verbunden mit zeitintensiven Methoden und basieren meist auf eher geringen absoluten Zahlen. Um diesen Bedarf zu decken wurde im Zuge dieser Arbeit zunächst eine Methode entwickelt, mit der Genom-Editierung basierend auf einer hohen Anzahl an Events robust quantifiziert werden kann. Diese Methode basiert auf das Vermitteln von Toxinresistenzen durch Genom-Editierung. Zellen, die durch Genom-Editierung Toxin resistent wurden, überleben die Behandlung mit entsprechenden Toxinen und wachsen zu Kolonien heran, die am Ende quantifiziert werden können. Für die Quantifizierung der Geninaktivierung wurden Genomeditierungssysteme gegen Gene gerichtet, die essentiell für die Synthese von Diphthamid sind. Das homozygote Inaktivieren dieser Gene führt zur Resistenz gegen Diphtherie Toxin, wodurch diese Editierungsereignisse durch Toxinselektion und Kolonieformierung quantifiziert werden können. Die genomische Integration eines Transgens für Puromyzin-NAzetyltransferase vermittelt hingegen permanente Resistenz gegen Puromyzin, wodurch Integrationsevents duch Puromyzinselektion quantifiziert werden können. Besonders hervorzuheben bei dieser Methode ist, dass dadurch ermöglich wird absolute Häufigkeiten der verschiedenen Editierungsevents vermittelt durch CRISPR/Cas9 zu bestimmen und auch mit weiteren Systemen wie Zinkfinger Nukleasen zu vergleichen. Des Weiteren ist mit dieser Methode gezeigt, dass Zinkfinger Nukleasen Genom-Editierung ähnlich effizient vermitteln wie das CRISPR/Cas9 System. Zudem wurde auf Grund dieser Häufigkeiten schnell ersichtlich, dass ortsgerichtete Integration von Transgenen mit einer Häufigkeit von 0.12% zu selten auftritt, um therapeutisch Anwendung zu finden. Homozygote Geninaktivierung mit einer Wahrscheinlichkeit von 6% hingegen kann durchaus für eine therapeutische Anwendung in Erwägung gezogen werden, vor Allem wenn nicht jede Zielzelle erfolgreich editiert werden muss um eine therapeutische Wirkung zu erzielen. Auf Grund der beschriebenen Vorteile und der umfangreichen Validierung wird diese Methode für die Entwicklung und Charakterisierung eines effizienten und gerichteten Gentherapiesystems verwendet. Spezifische Transgenexpression durch das Zielgewebe oder die Zielzellen ist hauptsächlich dadurch bedingt, dass das Transgen vornehmlich an diesen Zellen bindet und von diesen internalisiert wird. Diese Unterscheidung zwischen Ziel- und Nicht-Zielzelle kann durch Antikörper beziehungsweise Antikörperderivate ermöglicht werden. Dafür und für die flexible Verbindung von Antikörper und die Entität, die spezifisch zur Zielzelle gebracht werden soll, wurden bis-spezifische, Hapten bindende Antikörperformate verwendet. Diese Antikörperderivate binden mit einer Spezifität das Zelloberflächenantigen und mit einer weiteren Spezifität ein Hapten, beispielsweise Biotin oder Digoxigenin. In Kombination mit haptenylierter Nukleinsäure oder haptenylierten DNA bindenden Entitäten wurde ein flexibles System generiert, dass ein einfaches Austauschen von Antikörper und Nukleinsäure sowie das Vergleichen von beispielsweise verschiedenen Antikörperformaten ermöglicht. Anhand des TriFab Antikörperderivats wurden die grundlegenden Schritte der Antikörperentwicklung beschrieben, nämlich Design, Produktion, Aufreinigung und Charakterisierung. Die spezifische Aufnahme verschiedenster haptenylierter Moleküle, wie niedermolekulare chemische Substanzen, Nukleinsäuren oder Proteine durch den TriFab im Vergleich zu bivalenten bis-spezifischen Antikörperderivaten zeigt die vielfältigen Anwendungsmöglichkeiten des Hapten-Systems. Des Weiteren wurden Charakteristika dieser Antikörperderivate detailliert beschrieben und einzelne Entwicklungsaspekte erörtert. Im weiteren Verlauf dieser Arbeit wurde untersucht, ob sich das Hapten System eignet, um die spezifische Aufnahme von Transgenen zu vermitteln. Für eine effiziente intrazelluläre Aufnahme von Plasmid DNA in den Zellkern wurde angenommen, dass ein Verpacken dieser großen doppelsträngigen und zirkulären Nukleinsäure von Vorteil ist. Dafür wurde mit plasmid DNA durch Histon Assemblierung mittels Salzdialyse plasmid Chromatin rekonstituiert. Eigenschaften, die für die effiziente und funktionelle translokation von plasmid DNA in den Nukleus vorteilhaft sind, wie verbesserte Nukleaseresistenz und Reduktion der negativen Nettoladung, konnten gezeigt werden nachdem qualitativ hochwertiges Plasmid Chromatin generiert wurde. Um chemische Modifikationen mit unbekanntem Einfluss zu vermeiden, wurde die Verbindung zwischen plasmid DANN beziehungsweise Plasmid Chromatin und Hapten bindendem Antikörperderivat über das DNA bindende CPXM2 Peptid hergestellt, welches aus dem Carboxypeptidase-like protein X2 (CPXM2 Protein) stammt. Zunächst wurde die Interaktion zwischen TriFab Chromatin über das haptenylierte CPXM2 charakterisiert und mit dem bispezifischen bivalenten Antikörperformat verglichen. Da die Affinität zwischen bivalentem bispezifischem Antikörperderivat und Chromatin höher ist als die zwischen TriFab und Chromatin, vermutlich auf Grund der bivalenten Bindung zwischen Peptid und DNA im Falle des bivalenten Antikörperderivats, wurde das bivalente Format für weitere Analysen verwendet. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass dieses System plasmid DNA und plasmid Chromatin mit nahezu identischer Effizienz und hoher Spezifität an die Zielzellen bindet und deren Internalisierung mediiert. Der Einfluss der Histon vermittelten plasmid DNA Kompaktierung wurde erst ersichtlich, nachdem der Anteil Reportergen-exprimierender Zellen bestimmt und verglichen wurde. Die gezielte Aufnahme unverpackter plasmid DNA konnte keine signifikante Anzahl an Reportergen-exprimierenden Zellen vermitteln, wohingegen die gezielte Aufnahme an plasmid Chromatin bewirkte, dass ein hoher Anteil an Zellen das Reportergen exprimiert. Letztendlich wurde das initial verwendete CRISPR/Cas9 codierende Plasmid mittels des Antikörper-Chromatin Systems gezielt verabreicht und über die eingangs entwickelte Methode validiert. Die signifikante Anzahl an Zellklonen mit homozygoter Inaktivierung des Zielgens bewies, dass dieses System übertragbar und anwendbar für gezielte und therapeutische Genom-Editierung ist. Darüber hinaus stellt dieses System mit der hohen Spezifität eine neue Strategie der Gentherapie dar und könnte eine Möglichkeit eröffnen, therapeutische Genom- Editierung systemisch zu applizieren. Abschließend soll erwähnt sein, dass diese Arbeit die Entwicklung eines neuen und bislang einzigartigen Gentherapieansatzes beschreibt, welches die spezifische und effiziente Transgenaufnahme ausschließlich über Proteine bzw. Peptide vermittelt, die identisch zu humanen Proteinsequenzen sind.
Metadata last modified: 25 Nov 2020 17:43
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