Analysis of Allosteric Communication Pathways in Class I Glutamine Amidotransferases

Item type:	Thesis of the University of Regensburg (PhD)
Open Access Type:	Primary Publication
Date:	24 September 2019
Referee:	Prof. Dr. Reinhard Sterner
Date of exam:	4 September 2019
Institutions:	Biology, Preclinical Medicine > Institut für Biophysik und physikalische Biochemie > Prof. Dr. Reinhard Sterner
Keywords:	class I glutamine amidotransferases, allostery
Dewey Decimal Classification:	500 Science > 570 Life sciences
Status:	Published
Refereed:	Yes, this version has been refereed
Created at the University of Regensburg:	Yes
Item ID:	40722

Abstract (English)

Class I glutamine amidotransferases (GATases) represent a ubiquitous family of enzymes that catalyze the incorporation of ammonia within various metabolic pathways. GATases are heteromeric enzyme complexes consisting of at least one pair of glutaminase and synthase subunits in various oligomeric associations. The activities of the glutaminase and synthase subunits are allosterically coupled in ...

Abstract (English)

Class I glutamine amidotransferases (GATases) represent a ubiquitous family of enzymes that catalyze the incorporation of ammonia within various metabolic pathways. GATases are heteromeric enzyme complexes consisting of at least one pair of glutaminase and synthase subunits in various oligomeric associations. The activities of the glutaminase and synthase subunits are allosterically coupled in most class I GATases in a way that the presence of substrate at the synthase subunit stimulates glutamine hydrolysis at the glutaminase active site. The structural basis of allosteric communication between both subunits is, however, not well understood.

The first part of this thesis focuses on the molecular basis of allosteric coupling in 4-amino-4-deoxychorismate synthase (ADCS), an important but hitherto sparsely characterized member of class I GATases. Using ancestral sequence reconstruction, we generated a thermostable glutaminase subunit, anc2PabA, solved its crystal structure by molecular replacement and used it to compute for the first time a reliable model of the E. coli ADCS complex. Alanine scanning of conserved residues located between the glutaminase and synthase active sites revealed a network of mainly charged residues that lead to activity-inducing conformational changes at the glutaminase subunit. A central aspartate residue of the synthase subunit that is located at the synthase-glutaminase interface close to the active site of the glutaminase subunit, was identified as key residue for both complex formation and allosteric signaling.

The second part of this thesis describes the bioinformatic search and biochemical characterization of similarly located aspartate residues in the remaining members of class I GATases. The data confirms the important role of the identified aspartate residues for complex formation and allosteric signaling and is integrated toward a unifying allosteric core mechanism for class I GATases.

Translation of the abstract (German)

Klasse I Glutaminamidotransferasen (GATasen) repräsentieren eine weit verbreitete Enzymfamilie, die den Einbau von Ammoniak in einer Vielzahl metabolischer Pfade katalysieren. GATasen sind heteromere Enzymkomplexe, die aus mindestens einem Paar von Glutaminase- und Synthase-Untereinheiten in verschiedenen Oligomerisierungszuständen bestehen. Die Aktivitäten der Glutaminase- und ...

Translation of the abstract (German)

Klasse I Glutaminamidotransferasen (GATasen) repräsentieren eine weit verbreitete Enzymfamilie, die den Einbau von Ammoniak in einer Vielzahl metabolischer Pfade katalysieren. GATasen sind heteromere Enzymkomplexe, die aus mindestens einem Paar von Glutaminase- und Synthase-Untereinheiten in verschiedenen Oligomerisierungszuständen bestehen. Die Aktivitäten der Glutaminase- und Synthase-Untereinheiten sind in den meisten Klasse I GATasen allosterisch derart gekoppelt, dass die Anwesenheit des Substrates an der Synthase-Untereinheit die Glutaminhydrolyse am aktiven Zentrum der Glutaminase-Untereinheit stimuliert. Die strukturelle Grundlage dieser allosterischen Kommunikation ist noch wenig verstanden.

Der erste Teil dieser Arbeit behandelt die molekularen Grundlagen der allosterischen Kopplung von 4-Amino-4-Desoxychorismate Synthase (ADCS), einem wichtigen aber zugleich wenig charakterisierten Vertreter der Klasse I GATasen. Mit Hilfe von anzestraler Sequenzrekonstruktion, wurde eine thermostabile Glutaminase-Untereinheit anc2PabA erzeugt, deren Kristallstruktur durch molekularen Ersatz gelöst und damit das erste verlässliche Strukturmodell des ADCS Komplexes aus E. coli berechnet. Durch einen Alanin-Scan an konservierten Resten, die zwischen den aktiven Zentren der Glutaminase- und Synthase-Untereinheit lokalisiert sind, wurde ein Netzwerk von hauptsächlich geladenen Aminosäuren identifiziert, welches zu konformationellen , aktivierenden Änderungen an der Glutaminase-Untereinheit führt. Ein Aspartat-Rest der Synthase-Untereinheit, welcher an der Kontaktfläche zwischen Synthase- und Glutaminase-Untereinheit lokalisiert ist, wurde als entscheidender Rest für die Fähigkeit zu Komplexbildung und allosterischer Aktivierung identifiziert.

Der zweite Teil dieser Arbeit beschreibt die bioinformatische Suche und biochemische Charakterisierung von ähnlich lokalisierten Aspartat-Resten in weiteren Mitgliedern der Klasse I GATasen. Die generierten Daten bestätigten die wichtige Rolle der identifizierten Aspartat-Reste für die Fähigkeit zur Komplexbildung und Allosterischen Aktivierung und wurde zu einem allgemeinen Allosterischen Aktivierungsmechanismus für Klasse I GATasen vereint.

Details

Preview

Export bibliographical data

Abstract (English)

Abstract (English)

Translation of the abstract (German)

Translation of the abstract (German)

Download Statistics

Downloads

More literature (via CORE)

University Library