Zusammenfassung (Englisch)
This thesis investigated the impact and metabolism of the known oncometabolite D 2 hydroxyglutarate and its recently recognized lactone R-5-oxo-2-tetrahydro-furancarboxylic acid. Production and biological effects of 2 hydoxyglutarate are well described in the literature. However, accumulation of this metabolite as a result of insufficient degradation was studied for the first time in this thesis. ...
Zusammenfassung (Englisch)
This thesis investigated the impact and metabolism of the known oncometabolite D 2 hydroxyglutarate and its recently recognized lactone R-5-oxo-2-tetrahydro-furancarboxylic acid. Production and biological effects of 2 hydoxyglutarate are well described in the literature. However, accumulation of this metabolite as a result of insufficient degradation was studied for the first time in this thesis. Therefore, a cell-based enzyme assay was developed to measure D 2-hydoxyglutarate degradation by D 2 hydroxyglutarate dehydrogenase. Quantification of 2-hydroxyglutarate was accomplished by LC-MS/MS. Applying this assay, it was found that D 2 hydroxyglutarate dehydrogenase activity differs across cell lines but is not upregulated in response to elevated 2-hydroxyglutarate levels.
Moreover, in preliminary investigations on 2 hydroxyglutarate in serum of AML-patients with mutations in isocitrate dehydrogenase, 2 hydroxyglutarate-lactone was discovered. The HCT116 panel with IDH1/2 mutation served as a model to learn more about the novel metabolite as both metabolites – 2 HG and 2 HG lactone - can be detected in extracts of these cells. Thereby, 2 hydroxyglutarate was verified as the precursor by performing 13C5-glutamine tracing experiments. However, 2 hydroxyglutarate lactonization does not take place whenever the precursor is abundant, as for some biological specimens with elevated 2 hydroxyglutarate the lactone was not detectable. Further experiments provided hints that 2 hydroxyglutarate-lactone is of enzymatic origin but did not lead to the identification of this enzyme.
In doing all these experiments, interconversion of 2 hydroxyglutarate and its lactone needed to be controlled and required development of new protocols using different approaches of hyphenated mass spectrometry. For instance, set up of an enantioselective analysis of 2 hydroxyglutarate and its lactone was an objective of this thesis but was not achieved with the possibilities at the institute. Finally, this thesis provided insights into origin, fate and impact of 2-HG and 2-HG-lactone in the context of tumor metabolism.
Übersetzung der Zusammenfassung (Deutsch)
Diese Arbeit untersuchte die Auswirkungen und den Stoffwechsel von Onko-Metaboliten am Beispiel von D-2-Hydroxyglutarat und seinem Lacton, R-5-Oxo-2-tetrahydrofurancarbonsäure mit Hilfe einiger bioanalytischer Methoden. Die Produktion und die biologischen Effekte von 2 Hydroxyglutarat sind in der Literatur gut beschrieben. Im Gegensatz dazu wurde in dieser Dissertation die Akkumulation dieses ...
Übersetzung der Zusammenfassung (Deutsch)
Diese Arbeit untersuchte die Auswirkungen und den Stoffwechsel von Onko-Metaboliten am Beispiel von D-2-Hydroxyglutarat und seinem Lacton, R-5-Oxo-2-tetrahydrofurancarbonsäure mit Hilfe einiger bioanalytischer Methoden. Die Produktion und die biologischen Effekte von 2 Hydroxyglutarat sind in der Literatur gut beschrieben. Im Gegensatz dazu wurde in dieser Dissertation die Akkumulation dieses Metaboliten in Folgen seines ungenügenden Abbaus zum ersten Mal genauer untersucht. Um den Abbau von D 2 Hydroxyglutarat durch die D 2 Hydroxyglutarat-Dehydrogenase zu messen, wurde ein Zell-basierter Assay entwickelt. Die Quantifizierung von 2 Hydroxyglutarat erfolgte mittels einer LC-MS/MS-Methode. Die Anwendung des Enzym-Assays auf verschiedene Zelllinien zeigte unterschiedliche Aktivitäten für die D 2 Hydroxyglutarat-Dehydrogenase, die durch erhöhte 2 Hydroxyglutarat-Spiegel jedoch nicht wie erwartet hoch reguliert wurde.
Außerdem wurde bei (dieser Arbeit vorangegangener) Untersuchungen zu 2 Hydroxyglutarat in Serum von AML-Patienten mit Mutation der Isocitrat-Dehydrogenase das 2 Hydroxyglutarat-Lacton, der intramolekulare Ester des 2 Hydroxyglutarats, als endogener Metabolit identifiziert. Um mehr über den neuen Metaboliten zu erfahren, wurden einige Experimente durchgeführt. Dabei diente ein Set aus HCT116 Zelllinien, bestehend aus Zelllinien mit und ohne IDH1/2-Mutation als wichtiges Modell, da in Extrakten dieser Zellen sowohl 2-Hydoxyglutarat als auch das -Lacton nachgewiesen wurde. So zeigten Untersuchungen des Stoffwechsels in Zellen mit IDH1/2-Mutation durch Zugabe von 13C5 Glutamin, dass das 2 Hydroxyglutarat Lacton aus 2 Hydroxyglutarat gebildet wird. Weitere Daten dieses Versuchs zusammen mit Ergebnissen aus einem analogen Versuch, bei dem 13C6 Glucose eingesetzt und dessen Verstoffwechselung nachverfolgt wurde, zeigten die Auswirkungen einer IDH1/2-Mutation auf den zellulären Stoffwechsel. So wurde z.B. klar, dass diese Zellen vorwiegend Glutamin nutzten, um den erhöhten Verbrauch von α Ketoglutarat zur 2 Hydroxyglutarate-Synthese zu kompensieren. In Extrakten von einigen Seren oder Zellkultur-Proben mit erhöhtem 2 Hydroxyglutarat-Wert war das -Lacton nicht detektierbar. Daher scheint es, dass 2 Hydroxyglutarat in ausreichender Konzentration allein nicht ausreicht, um eine Laktonisierung beobachten zu können. In Zellkultur-Versuchen etwa wurde der 2 Hydroxyglutarat-Spiegel durch Zugabe des Zellmembran-permeablen 2 Hydroxyglutarate-Octyl-Esters unabhängig von einer IDH1/2-Mutation erhöht und immer die Laktonisierung beobachtet. Weitere Experimente lieferten Hinweise, dass das 2 Hydroxyglutarat-Lacton enzymatischen Ursprungs ist, aber letztendlich konnte das verantwortliche Enzym nicht identifiziert werden.
Es wurden daneben auch Versuche zu Untersuchung der biologischen Effekte von 2 Hydroxyglutarat und Lacton z.B. auf die Immunantwort von Makrophagen durchgeführt. Dabei wurde auch festgestellt, dass die Aufnahme-Raten von 2 Hydroxyglutarat und -Lacton (vermutlich bedingt durch verschieden Transporter) sich unterscheiden. Ebenso ist die intrazelluläre Hydrolyse-Rate des Lactons Zelltyp-spezifisch und erfolgt zumindest in Makrophagen enantioselektiv. Letztendlich war es schwer möglich, biologische Effekte eindeutig einem der beiden Metabolite, 2 Hydroxyglutarat und -Lacton, zuzuordnen.
Bei der Durchführung aller Versuche zu dieser Arbeit musste stets die mögliche, gegenseitige Umwandlung von 2 Hydroxyglutarat und -Lacton im Auge behalten werden. Daher wurde es auch notwendig, neue Methoden aus dem Bereich der gekoppelten Massenspektrometrie zu entwickeln. Beispielsweise wurde versucht eine enantioselektive Methode zur Quantifizierung von D-/L-2-Hydroxyglutarat und -Lacton zu etablieren. Hierzu wurden zwei verschiedene Ansätze getestet: zum einen die Verwendung enantioselektiver Chromatographie-Säulen, zum anderen eine Derivatisierung mit chiralen Reagenzien, wodurch Diasteromere entstehen. Jedoch war es mit den am Lehrstuhl verfügbaren Instrumenten und Mitteln nicht möglich eine valide, enantioselektive Methode für beide Analyten aufzusetzen. Die Ergebnisse dieser Arbeit basieren dementsprechend hauptsächlich auf Messungen mit einer (LC MS/MS)-Methode, die Enantiomere nicht unterscheiden kann, bzw. auf Daten chiraler GC-MS-Analysen von 2 Hydroxyxglutarat. So konnten dennoch einige Erkenntnisse über den Ursprung, das Schicksal und den Einfluss von zwei Metaboliten im Kontext des Tumor-Stoffwechsels gewonnen werden.
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