Abstract (German)
Die vorliegende Arbeit beschäftigte sich mit der Entstehung und den Auswirkungen von oxidativem Stress in den Zellen des parodontalen Ligaments (PDL). Der Begriff Oxidativer Stress beschreibt dabei eine potenziell schädliche Stoffwechsellage, bei der auf Grund einer gesteigerten Bildung von oxidativ wirksamen Molekülen (reaktive Sauerstoffspezies, ROS) ein gestörtes Verhältnis zwischen Oxidantien ...
Abstract (German)
Die vorliegende Arbeit beschäftigte sich mit der Entstehung und den Auswirkungen von oxidativem Stress in den Zellen des parodontalen Ligaments (PDL). Der Begriff Oxidativer Stress beschreibt dabei eine potenziell schädliche Stoffwechsellage, bei der auf Grund einer gesteigerten Bildung von oxidativ wirksamen Molekülen (reaktive Sauerstoffspezies, ROS) ein gestörtes Verhältnis zwischen Oxidantien und Antioxidantien vorliegt. Es wurden in-vitro-Experimente durchgeführt, in denen zunächst eine mögliche Freisetzung von ROS überprüft wurde. Hierdurch sollte die Fragestellung geklärt werden, ob durch bestimmte Faktoren, wie sie auch bei Parodontitis und kieferorthopädischer Zahnbewegung auftreten, überhaupt oxidativer Stress in den Zellverbünden der PDL-Fibroblasten auftritt. Im zweiten Teil der Arbeit sollten durch weitere Versuche die Auswirkungen eines ebensolchen ROS-Anstiegs auf den Zellstoffwechsel ergründet werden, indem wir die Fibroblasten direkt mittels ROS (H2O2) stimulierten, worauf die Aktivität der am Knochenstoffwechsel beteiligten Gene für IL-6, IL-8 und COX-2 gemessen wurde.
Die verwendeten PDL-Zellen wurden aus Weisheitszähnen von Patienten im Alter von 14-22 Jahren isoliert, wobei darauf geachtet wurde, dass es sich um karies- und entzündungsfreie Zähne handelte, deren Entfernung medizinisch indiziert war. Nachdem die gewonnen Zellen über spezifische Markergene identifiziert worden waren, erfolgten ihre Kultivierung und die jeweiligen Versuche.
Im ersten Teil fand eine Behandlung durch Druck (2g/cm²; 24 h), Hypoxie (48 h) und Lysate der parodontalpathogenen Bakterienspezies A. actinomycetemcomitans und P. gingivalis (12 h und 96 h) statt, wobei stets auch unbehandelte Kontrollen angelegt wurden. Daraufhin wurde eine Fluoreszenzfärbung der Proben mit dem Farbstoff DCFH-DA (Dichlorodihydrofluorescein diacetate) durchgeführt, worauf die Zellen mittels fluoreszenzaktivierter Durchflusszytometrie (Fluorescence activated cell sorting, FACS) vermessen werden konnten.
Wir fanden in den durch Druck und Hypoxie behandelten Proben in Relation zu den Kontrollen signifikant erhöhte ROS-Konzentrationen. Nach der Reizung durch Bakterienlysate zeigten sich hingegen allenfalls Tendenzen eines Anstiegs, die aber statistisch nicht signifikant waren. Begleitend wurde auch die Zellüberlebensrate in den Populationen untersucht, es kam dabei zu ähnlichen Ergebnissen. Sie sank nach Stimulation durch Druck und Hypoxie signifikant, im Fall der Bakterienlysate erhielten wir auch hier keine aussagekräftigen Veränderungen.
Im zweiten Teil sollten die Auswirkungen von ROS auf den Zellstoffwechsel beleuchtet werden. Dafür wurde nach Vorversuchen eine H2O2-Konzentration von 0,1 mM als geeignet befunden, der die Zellen anschließend über einen Zeitraum von 2 h ausgesetzt wurden. Die Messung der Genexpression erfolgte mittels RT-qPCR. Es fanden sich dabei für alle untersuchten Gene (IL-6, IL-8, COX-2) erhöhte Expressionsraten.
Ein weiterer Bestandteil der Arbeit lag in der Ergründung der Auswirkungen des Antioxidantiums N-Acetylcystein (NAC). Hierfür wurden innerhalb der Experimentreihe mit P. gingivalis auch Proben mit dieser Substanz versetzt, was zu einem signifikanten Rückgang der jeweiligen ROS-Konzentrationen führte. Analoge Ergebnisse fanden wir bei der Stimulation durch H2O2, nach der es ebenfalls zu einem Abfall der Expressionsraten für alle Gene kam, wenn die Zellen gleichzeitig mit NAC behandelt worden waren.
Die gefundenen Ergebnisse weisen einerseits darauf hin, dass bestimmte Reize, die während Parodontitis und kieferorthopädischer Zahnbewegung auftreten, in der Lage sind, oxidativen Stress in den Zellen des PDL auszulösen. Andererseits zeigte sich aber auch die Bedeutung gerade der ROS in der Reizantwort und der Signalweitergabe. Weiter lieferten die Untersuchungen Hinweise darauf, dass durch die Verwendung von Antioxidantien neue vielfältige Therapieansätze entstehen könnten. Mit diesen wäre es in Zukunft eventuell möglich, gerade komplexe Patientenfälle, bei denen eine Kombination aus Parodontitis und kieferorthopädischem Behandlungswunsch vorliegt, sicherer und vorhersagbarer zu behandeln.
Translation of the abstract (English)
In this study, we investigated the impact of reactive oxygen species (ROS) formation on periodontal ligament (PDL) fibroblasts. To elicit ROS production in PDL fibroblasts, we simulated stimuli that typically occur in orthodontic tooth movement and periodontitis, namely mechanical stress, hypoxia and bacterial infection. Alternatively, H2O2 was used as a surrogate for direct ROS stimulation of ...
Translation of the abstract (English)
In this study, we investigated the impact of reactive oxygen species (ROS) formation on periodontal ligament (PDL) fibroblasts. To elicit ROS production in PDL fibroblasts, we simulated stimuli that typically occur in orthodontic tooth movement and periodontitis, namely mechanical stress, hypoxia and bacterial infection. Alternatively, H2O2 was used as a surrogate for direct ROS stimulation of fibroblasts. A potential inhibitory effect of the antioxidant N-Acetyl-Cysteine (NAC) on the above stimuli was analysed to gauge its therapeutic potential. As main readouts, intracellular ROS levels, as quantified by fluorescence-activated cell sorting (FACS), and gene expression changes, assessed by RT-qPCR, were used.
Our experiments demonstrated a significant increase in intracellular ROS levels after applying mechanical stress and hypoxia to PDL fibroblasts, but not after the stimulation with bacterial lysates. Furthermore, stimulation of PDL fibroblasts with H2O2 significantly induced the expression of IL6, IL8 and COX2. These effects were blocked by applying the antioxidant NAC, which decreased both intracellular ROS levels and IL6, IL8 and COX2 expression levels in treated fibroblasts.
In conclusion, our findings suggest that peridontitis and orthodontic tooth movement induce oxidative stress in PDL fibroblasts, which results in increased expression of the pro-inflammatory genes IL-6, IL-8 and COX-2. The use of NAC was able to suppress these effects, suggestig a potential future avenue in therapy of periodontitis and control of orthodontic tooth movement.
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