| License: Creative Commons Attribution 4.0 (23MB) |
- URN to cite this document:
- urn:nbn:de:bvb:355-epub-433358
- DOI to cite this document:
- 10.5283/epub.43335
| Item type: | Thesis of the University of Regensburg (PhD) |
|---|---|
| Open Access Type: | Primary Publication |
| Date: | 26 May 2021 |
| Referee: | Prof. Dr. Achim Göpferich |
| Date of exam: | 27 May 2020 |
| Institutions: | Chemistry and Pharmacy > Institute of Pharmacy > Pharmaceutical Technology (Prof. Göpferich) |
| Keywords: | multivalent nanoparticles, virus-mimetic, heteromultivalent, targeting, AT1 receptor, ACE, mesangial cells, diabetic nephropathy, ligand mobility, pirfenidone. |
| Dewey Decimal Classification: | 600 Technology > 615 Pharmacy |
| Status: | Published |
| Refereed: | Yes, this version has been refereed |
| Created at the University of Regensburg: | Yes |
| Item ID: | 43335 |
Abstract (English)
Targeted nanomaterials are powerful platforms for biomedical applications. If designed correctly they have the potential to fulfill the ultimate requirements of an optimal treatment: the effective delivery of therapeutic agents to specific cells/tissues and the evasion of deleterious side effects. Among them, polymeric nanoparticles (NPs) appear highly promising, as they are biocompatible and ...
Abstract (English)
Targeted nanomaterials are powerful platforms for biomedical applications. If designed correctly they have the potential to fulfill the ultimate requirements of an optimal treatment: the effective delivery of therapeutic agents to specific cells/tissues and the evasion of deleterious side effects. Among them, polymeric nanoparticles (NPs) appear highly promising, as they are biocompatible and biodegradable, precisely tunable, and able to incorporate diverse cargos for therapeutic or diagnostic purposes. More so, they can be easily functionalized with ligands, such as small molecules, peptides or antibodies to increase their interaction with distinct cells.
Nevertheless, up to date targeted nanotherapies still fail to effectively fulfill their anticipated outcomes. This can be partially attributed to a lack of in vitro and in vivo target-cell specificity due to the ubiquitous presence of the addressed receptors. More so, an incomplete knowledge of the parameters governing multivalent interactions often results in a futile NP-design that yields inconsistent results. Additionally, when particles are administered to a living organism, they face an environment full of obstacles, such as biological barriers, flow conditions, or the adsorption of proteins, that hinder their targeting abilities. Furthermore, due to a limited awareness of the parameters that determine cargo loading on nanomaterials, the encapsulation of certain highly promising drugs is still challenging. Altogether, this translates into disappointing therapeutic outcomes.
The goal of this work was to develop a polymeric nanoscale therapeutic system, focusing on overcoming these issues, for the specific recognition of mesangial cells, as they are highly relevant therapeutic targets due to their significant involvement in the development of diabetic nephropathy.
Despite virus-like multivalent ligand display having made considerable advances at increasing NP interactions with cells, it has remained unsuccessful at enhancing the target cell-specificity in a polycellular environment. A fundamental reason is the failure to accurately mimic the viral host-cell recognition strategy and to implement its intricate multistep nature. Therefore, particles carrying out a stepwise cellular recognition were designed (Chapter 3). Influenza A virus, which requires enzymatic activation by the target cell prior to attaining cell entry, served as a model. Angiotensin-I (Ang-I), a peptide cleavable by cell membrane-bound angiotensin converting enzyme (ACE) to angiotensin-II (Ang-II), was used as a proligand. After ACE activation, interaction of particle-bound Ang-II with the Ang-II type 1 receptor (AT1R), triggers cellular uptake. The particles were characterized for their physicochemical characteristics and their avidity for the targets was investigated through enzyme kinetic assays and intracellular calcium measurements. Subsequently, the target-cell specificity in a complex in vitro setting was elucidated by confocal laser scanning microscopy and flow cytometry.
NP functionalization is usually attained by tethering ligands to their surface with linkers, such as poly(ethylene glycol) (PEG). However, the repercussion that simple particle design features have on the multivalent interactions are frequently vastly underestimated. In Chapter 4, ligand-functionalized particles with hetero- and homogeneous PEG shells were formulated in order to assess the effect of ligand mobility on the NP avidity and the particle fate after cell contact. More so, the superiority of ligand mobility over functionalization degree was investigated.
As nanoformulations are generally optimized in vitro, when they are administered in vivo the outcomes diverge tremendously. One of the reasons being that the latter conditions are immensely more complex, and thus, decrease the targeting abilities of NPs. Therefore, in Chapter 5, NPs with an enhanced in vivo mesangial cell recognition strategy were designed. Using again viruses as a blueprint, their initial step of cellular attachment was mimicked, as it serves the purposes of increasing the particle concentration at the host surface and promoting subsequent recognition steps. EXP3174, an AT1R antagonist, was selected as a ligand to mediate attachment. In combination with the previously established Influenza A virus-mimetic specific targeting, the cellular recognition was a three-step process. The interaction of the tethered ligands and the particles avidity for the addressed receptors were assessed. Flow cytometry and confocal microcopy were used to elucidate particle specificity and cellular interaction in vitro. More so, the targeting ability and in vivo mesangial cell-accumulation was investigated through immunohistochemistry and fluorescence microscopy methods.
To obtain NPs of therapeutic value, they must be loaded with drugs different approaches. The antifibrotic drug pirfenidone (PFD), is a highly interesting candidate for the treatment of mesangial cells in the context of diabetic nephropathy. However, due to its water solubility and lack of ionizable groups, its encapsulation through nanoprecipitation can be challenging. In Chapter 6 the parameters for loading PFD in polymeric NPs through nanoprecipitation were evaluated. The compatibility of PFD with the particle-forming polymers was assessed through thermodynamic prediction parameters. More so, the influence of the nanoprecipitation technique (bulk vs microfluidic manufacturing) on the drug loading and cellular interaction was determined. Additionally, spatial constrictions on the PFD incorporation were elucidated. Furthermore, the effects of co-encapsulating an additional drug molecule on the PFD loading and release were assessed.
Translation of the abstract (German)
Gezielte Nanomaterialien sind wertvolle Systeme für biomedizinische Anwendungen. Bei einem richtigen Design können sie die Anforderungen einer optimalen Pharmakotherapie erfüllen: die Abgabe von Therapeutika an bestimmte Zellen und die Umgehung der Nebenwirkungen. Insbesondere sind Polymer Nanopartikel (NPs) sehr vielversprechend, da sie biokompatibel und biologisch abbaubar sind, und ...
Translation of the abstract (German)
Gezielte Nanomaterialien sind wertvolle Systeme für biomedizinische Anwendungen. Bei einem richtigen Design können sie die Anforderungen einer optimalen Pharmakotherapie erfüllen: die Abgabe von Therapeutika an bestimmte Zellen und die Umgehung der Nebenwirkungen. Insbesondere sind Polymer Nanopartikel (NPs) sehr vielversprechend, da sie biokompatibel und biologisch abbaubar sind, und verschiedene Wirkstoffe in ihnen verkapselt werden können. Darüber hinaus können sie leicht mit Liganden wie kleinen Molekülen, Peptiden oder Antikörpern funktionalisiert werden, um ihre Wechselwirkung mit verschiedenen Zellen zu erhöhen.
Dennoch können bislang gezielte Nanotherapien ihre gesetzten Ziele nicht effektiv erfüllen. Dies kann teilweise auf einer unzureichenden in vitro- und in vivo-Zielzellspezifität zurückgeführt werden. Darüber hinaus führt eine unvollständige Kenntnis der Parameter, die eine multivalente Wechselwirkungen bestimmen zu einem NP-Design, das zu inkonsistenten Ergebnissen führt. Wenn Partikel einem lebenden Organismus verabreicht werden, sind sie außerdem einer Umgebung voller Hindernisse ausgesetzt, wie z. B. biologischen Barrieren, Fließbedingungen oder der Adsorption von Proteinen, die ihre Zielfähigkeiten behindern. Zudem ist die Verkapselung mehrerer vielversprechender Wirkstoffe nach wie vor eine große Herausforderung. All diese Faktoren führen zu mangelhaften therapeutischen Ergebnissen.
Ziel dieser Arbeit war es, ein Polymer Nanopartikel-System zu entwickeln, das diese Probleme überwindet, um Mesangialzellen spezifisch zu erkennen. Diese sind hochrelevante therapeutische Ziele aufgrund ihrer signifikanten Beteiligung an der Entwicklung der diabetischen Nephropathie.
Obwohl die virusähnliche Präsentierung multivalenter Liganden erhebliche Fortschritte bei der Erhöhung der NP-Zell Wechselwirkungen erzielt hat, ist es ihr nicht gelungen, die Spezifität der Partikel in einer polyzellulären Umgebung zu verbessern. Ein Grund hierfür ist die unvollständige Nachahmung der viralen Zielzellerkennungsstrategie, insbesondere die Implementierung ihrer mehrstufigen Natur.
Daher wurden in dieser Arbeit Partikel entworfen, die eine schrittweise zelluläre Erkennung durchführen (Kapitel 3). Als Modell diente das Influenza-A-Virus, das vor Erreichen des Zelleintritts eine enzymatische Aktivierung durch die Zielzelle erfordert. Angiotensin-I (Ang-I), ein Peptid, das durch zellmembrangebundenes Angiotensin-konvertierendes Enzym (ACE) zu Angiotensin-II (Ang-II) gespalten werden kann, wurde als Proligand verwendet. Nach der ACE-Aktivierung löst die Wechselwirkung von partikelgebundenem Ang-II mit dem Ang-II-Typ-1-Rezeptor (AT1R) die Zellaufnahme aus. Die Partikel wurden hinsichtlich ihrer physikochemischen Eigenschaften charakterisiert und ihre Avidität für ACE und den AT1R wurde untersucht. Anschließend wurde die Zielzellspezifität in einer komplexen In-vitro-Umgebung durch konfokale Laserscanmikroskopie und Durchflusszytometrie analysiert.
Die NP-Funktionalisierung wird normalerweise erreicht, indem Liganden mit Linkern wie Poly (ethylenglykol) (PEG) an ihre Oberfläche gebunden werden. Die Auswirkungen, die einfache Partikelentwurfsmerkmale auf die multivalenten Wechselwirkungen haben, werden jedoch häufig stark unterschätzt. In Kapitel 4 wurden Ligand-funktionalisierte Partikel mit hetero- und homogenen PEG-Hüllen formuliert, um den Einfluss der Liganden-Mobilität auf die NP-Avidität und das Partikelschicksal nach Zellkontakt zu bewerten.
Da Nanoformulierungen in vitro optimiert werden, weichen die Ergebnisse bei der Verabreichung in vivo erheblich voneinander ab. Einer der Gründe ist, dass die letzteren Bedingungen immens komplexer sind und somit die Zielfähigkeiten von NPs verringern. Daher wurden in Kapitel 5 NPs entwickelt, die in vivo Mesangialzellen erkennen können. Es wurden erneut Viren als Inspiration genommen und ihr erster Schritt der zellulären Bindung nachgeahmt. Dieser dient dazu, die Partikelkonzentration an der Wirtsoberfläche zu erhöhen und nachfolgende Erkennungsschritte zu fördern. EXP3174, ein AT1R-Antagonist, wurde als Ligand ausgewählt, um die Bindung zu vermitteln. In Kombination mit dem zuvor etablierten Influenza A-Virus mimetischen Targeting wurde die zelluläre Erkennung ein dreistufiger Prozess. Die Wechselwirkung der gebundenen Liganden und der Partikelavidität für die adressierten Rezeptoren wurde bewertet. Durchflusszytometrie und konfokale Mikrokopie wurden verwendet, um die Partikelspezifität und die zelluläre Wechselwirkung in vitro aufzuklären. Darüber hinaus wurde die Targeting-Fähigkeit und die Akkumulation in Mesangialzellen in vivo durch immunhistochemische und fluoreszenzmikroskopische Methoden untersucht.
Um Therapeutische NPs zu entwickeln, müssen Partikel mit Wirkstoffen beladen werden. Das Antifibrotikum Pirfenidon (PFD) ist ein hochinteressanter Kandidat für die Behandlung von Mesangialzellen im Rahmen der diabetischen Nephropathie. Aufgrund seiner Wasserlöslichkeit kann seine Verkapselung durch Nanopräzipitation jedoch eine Herausforderung darstellen. In Kapitel 6 wurden die Parameter für die Beladung von Polymer NPs mit PFD durch Nanopräzipitation bewertet. Die Verträglichkeit von PFD mit den partikelbildenden Polymeren wurde durch thermodynamische Vorhersageparameter bewertet. Darüber hinaus wurde der Einfluss der Nanopräzipitationstechnik auf die Wirkstoffbeladung und die zelluläre Wechselwirkung bestimmt. Zusätzlich wurden räumliche Einschränkungen der PFD-Verkapselung aufgeklärt und die Auswirkungen der Ko-Verkapselung eines zusätzlichen Wirkstoffmoleküls untersucht.
Metadata last modified: 26 May 2021 06:53
Owner only: item control page
Download Statistics